1.4 色谱条件

色谱柱：SHIM-PACK VP-ODS C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：100%甲醇-5%甲酸溶液(5:95)；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；检测波长：256、285、320nm；进行洗脱梯度。

1.5 蜂蜜多酚物质的提取

在Lihu等[10]的基础上进行了改进，具体步骤如下：取100g蜂蜜样品溶于500mL盐酸溶液(pH2)中，室温下磁力搅拌3min，溶解均匀后通过滤棉除去溶液中的固体颗粒。滤液与150g Amberlite XAD-2(孔径9nm，粒度0.3～1.2mm)树脂混合，磁力搅拌10min，使多酚物质被充分吸附。将树脂颗粒装入玻璃柱(55cm×3.0cm)中，用250mL盐酸溶液(pH2)冲洗柱子，之后用300mL蒸馏水漂洗柱子以除去全部糖类物质及其他杂质。用400mL甲醇将酚类物质洗出，并将洗脱液在45℃真空旋转蒸干(100r/min)，残留物用5mL水溶解，再用15mL乙醚分3次萃取。醚提取物混合后在30℃条件下去除乙醚，干渣用1mL甲醇复溶，0.45μm滤膜过滤后进样。

1.6 标准溶液配制

分别称取各标准品10mg置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液，并置于4℃冰箱中避光保存，其他质量浓度标准品由储备液稀释得到。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 检测波长的选择

将15种标准品储备液配制成100μg/mL的单标工作液，分别在200～400nm波长范围内进行扫描，得出各对照品的紫外吸收峰，主要集中在256、280、285、320、360nm五个波长。在这5个波长下对75μg/mL的混合标准品进行检测，发现在256、285nm及320nm波长处的出峰数及分离效果最好，干扰最小，故选择这3个波长作为检测波长。

2.1.2 梯度洗脱条件的选择

参考陈滨等[11]的洗脱条件，考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-5%甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸对15种混合标准品的分离情况。在35℃柱温条件下，以0.8mL/min的流速进样20μL，对3种流动相进行选择，发现甲醇-0.1%的甲酸不能将15种物质完全分离，仅能分离出12种物质；甲醇-5%的甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸均可以使15种混合标准品完全分离，且峰形较好，考虑到柱子对酸的耐受程度，最终选择甲醇-5%甲酸作为流动相(图1)。

采用陈滨等 [11]的洗脱条件进行洗脱，虽然可以使混合标准品得到较好分离，但是对蜂蜜样品的分离不是特别理想，多酚物质的保留时间短，于是对洗脱时间及流动相比例进行调整，确定洗脱梯度为时间0～6min时，对应甲醇体积分数2 %～8 %；6～10min，8%～15%；10～20min，15%～17%；20～30min，17%～32%；30～60min，32%～42%；60～70min，42%～50%；70～71min，50%～100%；72～77min 用以平衡色谱柱，对应甲醇体积分数 2 % 。

2.1.3 流速的选择

对0.5、0.8、1.0mL/min三个流速进行考察对比，发现0.5mL/min时，样品保留时间较长，1.0mL/min时压力比较大，综合考虑后确定0.8mL/min作为最终流速。

2.2 标准曲线的建立

分别取储备液适量，用甲醇配制成质量浓度为230、150、110、76.38、60、20、5、2.5μg/mL的混合标准溶液，按2.1节所确定的色谱条件进样分析，平行测定3次，以标准品含量为横坐标，以平均峰面积为纵坐标得到15条标准曲线(表1)。

从表1可见，相关系数均大于0.995，表明在此质量范围内，各对照品质量浓度与峰面积相关性良好。

2.3 精密度实验

取质量浓度为76.38μg/mL的混合标准品，重复进样6次，求得各色谱峰相对峰面积的RSD在0.18%～1.45%之间，相对保留时间的RSD在0.09%～1.04%之间，色谱峰的个数及特征没有明显变化，精密度较好。