2008 年,Mavric 等[4]发现甲基乙二醛( methylglyoxal,MGO)可能是 Manuka 蜂蜜具有 NPA 的主要物质基础。同年,Adams 等[5]也报道了相同的结论,并且发现 Manuka 蜂蜜中 MGO 的含量与 NPA 的相关性高达 0. 98。由于采用微生物方法检测 NPA 操作比较繁琐,结果变异较大,而且物质基础不明确,因此部分研究人员呼吁采用 MGO 的含量来代替UMF 值用于标示 Manuka 蜂蜜的 NPA。但是,也有部分研究人员认为还没有充分的证据证明 MGO 能完全代表 Manuka 蜂蜜的 NPA,而且 UMF 更能体现新西兰 Manuka 植物的地域独特性和绿色环保理念。因此,目前市场上销售的 Manuka 蜂蜜的产品包装上会有 UMF 和 MGO 两种指标来标示 Manuka蜂蜜的抗菌活性。
目前国内对 Manuka 蜂蜜的研究较少,且主要集中在其抗菌活性方面。朱威等[1]和玄红专等[2]综述了国外对 Manuka 蜂蜜抗菌活性的研究。孙艳萍等[6]研究了 Manuka UMF25 + 、UMF10 + 以及其他 7 种蜂蜜对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性,结论为 9 种蜂蜜在体外均可抑制铜绿假单胞菌,进口蜜更佳。对 Manuka 蜂蜜中相关物质的检测方法,仅见吕辰等[7]采用高效液相色谱-串联质谱法对多种蜂蜜中的 5 种双稠吡咯啶类生物碱进行了筛查,结果发现野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出,而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出。
MGO 属于二羰基化合物,国内报道的检测方法集中在大气环境监测领域。李阳等[8]建立了一种五氟化苯肼衍生化-热解吸-GC /MS 方法对大气中23 种羰基化合物进行了测定。牟翠翠等[9]和冯艳丽等[10]分别报道了 2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法用于测定大气中二羰基化合物。邹婷等[11]采用五氟苄基羟胺衍生与 GC /MS 联用的方法分析了大气中的单羰基化合物和多羰基化合物。对于蜂蜜中 MGO 的检测方法,目前国内尚无相关文献报道。对此,本实验室开发了高效液相色谱法对Manuka 蜂蜜的 MGO 含量进行检测。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
Agilent 1200 液相色谱仪,配有自动脱气机、二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器及 ChemStation 数据处理软件( 美国 Agilent 公司) ;PURELAB Option-Q15 纯水仪( 英国 ELGA 公司) ; 电子天平( 精确到 0. 000 01 g,德国 Sartorius 公司; 精确到 0. 01 g,瑞士 METTLER TOLEDO 公司) 。
MGO 对照品( 40% 水溶液) 购自美国 SigmaAldrich公司; 邻苯二胺( o-phenylenediamine,OPD)购自阿拉丁化学试剂( 上海) 有限公司; 甲醇( 色谱纯,德 国 Merck 公 司 ) ;水为超纯水(18.2MΩ·cm);0.22μm有机滤膜(德国Membrana公司) 。
Manuka 蜂蜜样品由新西兰 UMF 蜂蜜协会提供,中国蜂蜜样品由通标标准技术服务有限公司提供。
1. 2 标准溶液的配制
精密量取 MGO 对照品 100 μL,用水稀释并定容至 10 mL,配成 4 g /L 的标准储备液( 4 ℃ 避光保存) 。临用前用水将标准储备液逐级稀释为适当浓度的标准工作溶液。
精密称取邻苯二胺 0. 6 g,用水溶解并定容至100 mL,配成 6 g /L 的邻苯二胺水溶液。
1. 3 样品前处理
称取 1 g 蜂蜜溶于 10 mL 水中,取 1 mL 该蜂蜜水溶液与 1 mL 邻苯二胺水溶液( 6 g /L) 混匀,在室温、避光条件下进行衍生化反应 8 h 以上,过 0. 22μm 滤膜后进样分析。
1. 4 液相色谱条件
色谱柱: Kromasil 反相色谱柱( 150 mm × 4. 6mm,5 μm) ; 流动相: 0. 1% ( v /v) 乙酸水溶液( A) 和甲醇( B) ; 检测波长: 318 nm; 流速: 1. 0 mL /min; 柱温: 30 ℃ ; 进样量: 10 μL; 保留时间: 10. 3 min。梯度洗脱程序: 0 ~ 5 min,30% B; 5 ~ 10 min,30% B ~90% B; 10 ~ 15 min,90% B; 15 ~ 16 min,90% B ~30% B; 16 ~ 20 min,30% B。