1.6蜂蜜中总黄酮含量的测定

准确吸取2mL3g/mL的蜂蜜水溶液于20mL容量瓶中，各瓶中分别加入0.6mL15g/100mL的NaN03溶液，再加入0.6mL10g/100mL的AICl3溶液，8mL4g/100mL的NaOH溶液，混匀后用蒸馏水定容至刻度。室温静置15min后，于415nm波长处测定吸光度值。将对照品槲皮素配置成0.2mg/mL的标准溶液，按照上述方法制定标准曲线。蜂蜜总黄酮含量以槲皮素的相对量表示[8]。

 

1.7蜂蜜醇提物的HPLC分析

1.7.1实验材料制备

蜂蜜中含有大量糖类大分子，采用HPLC方法时，需将蜂蜜进行预处理，以免大分子堵塞高效液相色谱仪而造成损坏。具体步骤如下：取100g蜂蜜样品溶于500mL蒸馏水，用HCl溶液调节至pH2.0，在室温下用磁力搅拌器搅拌均匀，然后通过过滤棉除去溶液中的固体颗粒。过滤后的溶液与150g  Amberlite XAD-2(孔径为9nm，颗粒大小0.3一1.2mm)混合，用磁力搅拌器搅拌10min。将Amberlite颗粒装在玻璃柱(42×3.2)中，然后用酸水(250mL，pH2.0HCl)冲洗柱子，随后用蒸馏水漂洗柱子以去除全部糖类物质及其它组分。酚类物质保留在柱中，用400mL甲醇将酚类物质洗出。甲醇提取物在40°C条件下用旋转蒸发仪蒸干，残留物溶解于5mL蒸馏水，用乙醚(5mL×3)提取。醚提取物混合后，在氮气条件下去除乙醚。干渣用甲醇复溶，配制成10mg/mL的蜂蜜醇提物。0.45μm滤膜过滤后进样[9]。

 

1.7.2色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse  XDB C18色谱柱(4.6mm×150mm×5μm)；流动相：甲醇(流动相A)和0.1%甲酸一水溶液(流动相B)；梯度洗脱，其时间程序为0min→10min→20min→30min→60min→70min→75min→80min；甲醇含量0%→15%→17%→32%→42%→50%→65%→25%，流速：1.0mL/min；DAD检测波长：256nm，280nm；迸样量20μL；柱温：35°C。

 

1.7.3标准溶液的配制

分别称取各对照品5mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解，用甲醇稀释至刻度，终浓度为1mg，/mL，经0.45μm滤膜过滤后置于4°C冰箱中避光保存，作为储备液备用，其他浓度对照品由储备液稀释得到。

1.8蜂蜜总抗氧化性的测定采用普鲁士兰法。准确吸取lmL各浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/mL)样液，加入2.5mL PBS缓冲液(0.2M，pH6.6)，再加人2.5mL铁氰化钾溶液；50°C水浴20min后，加入2.5mL三氯乙酸摇匀，取7.5mL样液，加入同体积双蒸水，再加入1.5mL FeCl3溶液。摇匀，静置10min，于700nm测定吸光值，以芦丁作阳性对照。蜂蜜总抗氧化能力以蜂蜜浓度-吸光值线性回归方程斜率(K)表示[10]。