1 材料与方法

1.1 材料

茶花粉 SOD  本实验室提纯。

丙烯酰胺(Acr)、N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)及N, N,N′, N′-四甲基乙二胺(TEMED) 宝泰克公司;两性电解质载体、二甲氨基丹磺酰氯(DNS-Cl)、氯化硝基四氮 唑蓝(NBT)及标准氨基酸 Sigma公司;其余试剂均为国 产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 SOD活力测定 

采用改进的邻苯三酚自氧化法[2]。

1.2.2SOD 活性染色及类型鉴定

参照Hara PM[3]和罗广华[4]等的凝胶电泳活性染色法。

1.2.3 蛋白质含量测定

Folin酚法[5]测定蛋白浓度,以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.4 等电点的测定 

圆盘连续等电聚焦电泳法[6],凝胶浓度为7 %的聚丙烯酰胺,1 %的两性电解质载体(pH梯度为3.5~10)。 

1.2.5 分子量及亚基分子量的测定

采用不连续SDS-PAGE系统[7],浓缩胶浓度为3 %, 分离胶浓度为10%,电泳缓冲液中SDS浓度为2.5%, 测定全酶分子量时样品缓冲液不加SDS。

1.2.6 N- 末端氨基酸测定 

采用DNS-Cl法[8],将得到的DNS-氨基酸通过聚酰胺薄膜单向层析及双向层析和夹心型聚酰胺薄膜法鉴 定。夹心型聚酰胺薄膜法是在膜的一侧点DNS-氨基酸 标准样,另一侧点待测样,进行双向层析,第一相展 层液为甲酸(88%):水=1.5:100(V/V),第二相展层液为苯: 冰乙酸 =9:1(V/V),展层后利用膜的透明性鉴定 N- 末端 氨基酸。

1.2.7 氨基酸分析 

835-50氨基酸[9]自动分析仪测定。

1.2.8SOD 的圆二色谱分析[10]

用JASCO 810圆二色谱仪测定,蛋白浓度为43.2μg/ml。

1.2.9pH 稳定性研究

将相同量的酶溶液 pH 值分别调至 0.5~12,依次测活,确定 p H 对该酶的影响。

1.2.10 温度稳定性研究

将纯化的 SOD 溶于 pH6.5 的 25mmol/L 磷酸钾缓冲液(PBK)中,分别在0~100°C下保温30min后测定酶活性。

1.2.11 化学试剂对酶活性的影响 

将等量的SOD分别用5mmol/L KCN、10mmol/L KCN;5mmol/L H2O2;CHCl3-CH3CH2OH(3:5/V:V); 0.5%EDTA、5%EDTA;0.5%巯基乙醇、1%SDS、4mol/L 尿素溶解,室温放置30min后测定酶活性。对照液为相 应不加酶液的化学试剂。

1.2.12 金属离子对酶活性的影响

分别用含2mmol/L EDTA的pH5.0和7.0的PBK缓冲液溶解SOD,2h 后用G25 层析柱去除EDTA,取样测 定SOD活性。

取去除金属离子的SOD溶液25μl分别加入10μl10mmol/L的Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+,按前述方法测定SOD 活性。