蜜蜂网消息 蜂胶中9种酚类化合物的高效液相色谱分析 摘 要：建立了测定蜂胶中9种酚类物质含量的反相高效液相色谱法。色谱条件：色谱柱为ZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm，5.0μm)，流动 相为甲醇-0.1%甲酸，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为280、320和360nm。该方法准确、稳定、重现性好、加样 回收率高。用此方法测定了我国不同产地蜂胶样品中9种酚类物质的含量。结果表明：不同产地蜂胶样品中9种酚类物质含量存在差别，极性较大的酚酸类化合物的含量差异较大。关键词：蜂胶，高效液相色谱，黄酮类化合物，酚酸蜂胶是蜜蜂从植物的叶芽与树皮上采集的树脂，由蜜蜂混入蜂蜡和上颚腺分泌物形成的胶状物质。制剂理研究表明：蜂胶具有抗细菌、消炎、提高机体免疫力、抗癌以及抗氧化等多种生物功能⑴，因此，蜂胶在保健食品和医 制剂行业中得到广泛的应用。已知蜂胶中含有150多种化合物⑵，其中具有生物活性的物质包括：酚酸类化合物、黄酮类化合物以及它们的衍生物，这些物质含量的 高低将直接影响到蜂胶产品的保健功能和内在质量。中国虽然是世界蜂胶生产大国，但是对蜂胶活性含有的研究较少，尤其缺乏对其中生物活性含有定量分析方法学的研究。本文采用高效液相色谱.二极管阵列检测器串 联法，研究了中国蜂胶中酚类化合物的定量分析方法，同时测定了不同产地蜂胶样品中9种酚类化合物的含量。该研究结果对蜂胶产品的质量控制和蜂胶原料的标准 制定均有重要的参考价值。1、材料与方法1.1仪器和试剂1.1.1仪器HP1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括四元梯度泵(G1311A)、二极管阵列检测器(G1315A)；Milli2QG超纯水制备仪(美国Millipore公司)。1.1.2试剂甲 醇为色谱纯，水为超纯水，甲酸为分析纯。咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素和白杨素购自Sigma公司；山奈酚、芹菜素和高良姜素购自陕西 慧科植物开发有限公司，含量＞95%。蜂胶样品分别采自陕西、河南、湖北、辽宁、贵州、山东、河北、浙江和甘肃等9个省份，每个省份采集5个蜂胶样品，并 按照SB/T10096-1992蜂胶标准进行鉴定。2、实验方法2.1蜂胶样品的处理方法将采集到的蜂胶样品在-18℃冰箱中冷冻5h，然后用植物样品粉碎机粉碎至40目。取 粉碎后的蜂胶样品5g，用50mL95%乙醇在常温下提取12h，滤纸过滤提取液，残渣再用50mL95%乙醇在常温下提取6h，合并2次提取 液，8000rpm离心10min。取上清液在40℃下减压回收乙醇，残渣在真空干燥箱中干燥，蒸发除去水分得蜂胶浸膏。称取50mg浸膏，用甲醇溶解并 定容至10mL，经0.45μm微膜过滤，移取10μL滤液用于色谱分析。2.2对照品溶液的配置称 取咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素对照品适量，用甲醇溶解并定容，摇匀，配得咖啡酸、ρ-香豆酸、反 式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素质量浓度分别为 0.052，0.051，0.056，0.065，0.12，0.15，0.13，0.16和0.12g/L的对照品溶液，作为储备液。其他不同浓度的各 对照品溶液由各自的储备液经甲醇稀释得到。ZorbaxSB- C18色谱柱(150mm×4.6mm，5.0μm)；柱温为30℃；流动相为甲醇-0.1%甲酸，梯度洗脱，其时间程序为 0min→30min→60min→70min→75min→80min，甲醇含量25%→55%→80%→95%→95%→25%，流速 1.0mL/min；二极管阵列检测波长为280、320和360mm，并进行190～400nm全波长扫描。3、结果与讨论3.1样品提取溶剂的选择我 们曾研究了不同溶剂对蜂胶黄酮类化合物提取率的影响，结果发现，用乙醇作为溶剂时，总黄酮的提取率最高⑶。本文进一步考察了不同乙醇浓度对咖啡酸、ρ-香 豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、芹菜素、生松素、白杨素山奈酚和高良姜素提取率的影响，发现95%的乙醇对上述物质的提取率最高，故本实验以95%的乙醇作为 提取溶剂。3.2色谱分离条件的优化参考文献报道的色谱条件⑷~⑹，并根据这9种酚类化合物的性质，先后试验了不同比例的甲醇一水.甲酸作为流动相的等度洗脱以及各种梯度洗脱，并对色谱条件进行了优化。实 验结果表明：仅用甲醇.水作流动相，酚类化合物不能得到很好的分离，色谱峰出现不同程度的拖尾。其主要原因是酚类化合物结构中的酚羟基发生了解离，造成其 在固定相表面上有双重的保留机制。随着流动相中加入甲酸后，抑制了酚羟基的解离，使酚类化合物在反相色谱条件下成为中性疏水缔合物，色谱峰的对称性增强。 考虑到色谱柱的耐酸性，本实验选用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相，采用不同比例甲醇和0.1%甲酸水溶液梯度沈脱，在80min内可使蜂胶中大多数 含有达到较好的分离图1蜂胶的色谱图 1.咖啡酸，2.ρ-香豆酸，3.阿魏酸，4.肉桂酸，5.山奈酚，6.芹菜素，7.生松素，8.白杨素，9.高良姜素3.3线性关系考察分 别移取一定体积的咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素各储备液于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，使咖 啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸和肉桂酸质量浓度范围为1.0～15.2mg/L，生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素质量浓度范围为 3.0～50.6mg/L。将上述混合对照品溶液分别平行测定3次，以平均峰面积у对被测物的质量浓度х(μg)进行线性回归。9种被测物质的回归方程和 相关系数见表1。表1，9种酚酸的回归方程及相关系数 3.5精密度和稳定性实验精密吸取蜂胶提取液10μL(产地：陕西秦岭)，重复进样6次进行测定，咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜 素峰面积积分值的相对标准偏差(RSD)分别为2.12%，1.98%，1.65%，2.31%，1.92%，2.15%，1.75%，2.03%和 2.17%。对陕西产的蜂胶提取液在8h之内每隔1h进行1次测定，考察供试品溶液的稳定性，8h内咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、 芹菜素和高良姜素的色谱峰面积积分值的RSD分别为2.32%，2.03%，2.17%，1.95%，2.62%，2.08%，2.83%，2.16%和 2.25%。3.6加标回收率试验准 确称取粉碎后的粗蜂胶粉末约100mg(产地：陕西秦岭)，共5份，每份分别加入“1.2.2”项中各对照品储备液300μL，按“1.2.1”方法制备 蜂胶供试品溶液后进行测定。计算咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素的平均加标回收率(见表2)。表2，9种酚酸的加标回收率(n=5)

组分

含量

加入量

检测量

回收率

RSD

咖啡酸

100.9

15.6

115.3

99.1

2.16

ρ-香豆酸

43.3

15.3

59.8

102.0

2.03

阿魏酸

27.8

16.8

43.7

97.9

1.96

肉桂酸]

24.5

19.5

44.1

l00.2

1.87

山奈酚

34.4

36

69.3

98.4

2.3l

芹菜素

46.1

45

90.2

99.0

2.05

生松素

500.1

39

538.6

99.9

1.59

白杨素

573.5

48

622.7

100.2

2.16

高良姜素

372.4

36

407.3

99.7

1.79

3.7样品测定按照“1.2.1”节方法制备蜂胶供试液，用此法对8个不同产地的蜂胶样品中8种酚类化合物的含量进行了测定，结果见表3。表3不同产地蜂胶样品的酚酸含量(n=5)

组分含量(%)

陕西

湖北

辽宁

贵州

山东]

河北

浙江

甘肃

咖啡酸

0.06

0.51

0.68

0.46

0.12

0.31

0.56

0.03

ρ-香豆酸

0.07

0.25

0.41

0.08

0.35

0.34

0.28

0.03

阿魏酸

0.07

0.22

0.23

0.25

0.21

0.29

0.22

0.06

肉桂酸

0.14

0.19

0.24

0.28

0.19

0.29

0.13

0.22

山奈酚

0.06

0.28

0.27

0.39

0.02

0.36

0.42

0.3l

芹菜索

0.26

0.37

0.37

0.49

0.12

0.46

0.47

0.55

生松素

2.12

2.01

2.45

2.51

2.05

2.18

2.14

1.85

白杨素

3.17

2.59

2.02

2.38

2.16

3.56

2.51

2.05

高良姜素

1.82

1.68

1.27

1.67

1.17

3.44

1.56

1.95

由表3可知，不同产地蜂胶样品中肉桂酸和8种酚类化合物的含量差异较大，其中所有供试样品中黄酮类化合物的含量均显著高于酚酸类化合物。这可能与蜂 胶来源于不同产地以及不同的胶源植物有关⑺。所有供试蜂胶样品中的生松素、白杨素和高良姜素含量均大于2%，这三种含有可以作为评价蜂胶质量优劣的基本含有.4、结论本 文建立了高效液相色谱同时测定蜂胶中咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素等9中酚类化合物的分析方法。该 法使蜂胶中的大多数组分得到了基线分离，是一种灵敏、准确和稳定的分析方法。在蜂胶原料及其产品的质量控制方面具有重要的参考价值。