摘要：蜂微孢子虫病是蜜蜂的检疫性病害，该病严重阻碍了蜂群的生产繁殖。微孢子虫孢子侵入寄主细胞有3种方式：发芽侵染、自发感染、细胞内吞感染，又以发芽侵染为主。微孢子虫孢子表面蛋白与孢子发芽密切有关，找到孢子表面发芽关键蛋白将有助于揭示微孢子虫的侵染机制。 关键词：微孢子虫；发芽 微孢子虫(Microsporidia)是专性细胞内寄生的单细胞真核生物。1998年，Cavalier-Smith根据微孢子虫蛋白等分子分类研究结果，将其从原生动物界(Protozoa)移入菌物界(Fungi)的Eomycota亚界。已报道的微孢子虫有144个属1200多种，几乎在所有动物中都可发现它的踪迹，但昆虫是最大的寄主类群。蜂微孢子虫病是重要的检疫性病害。西方蜜蜂(Apis mellifera)普遍受到感染，且感染率较高；中蜂(A.cerana cerana)也有感染，但感染中蜂的微孢子虫与感染西方蜜蜂的微孢子虫不同。 1 微孢子虫对蜜蜂的危害 无论在东方蜜蜂还是西方蜜蜂中，微孢子虫的单一感染很少造成蜜蜂的急性死亡，因而常被忽视。但因慢性感染造成的营养不良、体质下降、寿命缩短、产量下降、蜂王损失等危害不仅造成蜂群衰亡，使生产和繁殖均受影响，而且因授粉能力下降而带来的农业损失难以估量。蜂微孢子虫往往与其他病原微孢子虫一起感染蜜蜂，引发并发症，加速蜜蜂的衰弱和死亡，危害往往比单一病害造成的损失严重得多，如意蜂爬蜂病就是很好的例证，除西蜂微孢子虫外，还有蜜蜂马氏管变形虫(Mapighamoeba mellificae)、蜜蜂螺原体(Spiroplasma melliferum)，慢性麻痹病毒等多种病原复合感染而大量爬蜂死亡。 2 微孢子虫的侵染机制 2.1 孢子发芽侵染 微孢子虫有特殊的侵染方式。侵染过程可分为两步，首先，孢子在特定条件下被活化，孢内的极丝快速外翻弹出，孢原质通过中空的极丝注入寄主细胞，此过程亦称孢子发芽。后极泡，极膜层等孢内结构参与了此过程。其次，脑原质在细胞内分裂繁殖，并成功地产生新孢子。大量体外实验表明，许多因子可激发孢子发芽，如pH的改变，干燥失水后再水化，高渗透压，阴/阳离子，紫外线，过氧化氢等处理，但不同微孢子虫所需的条件不同。 发芽前，首先是孢子膨大，这是由于孢子内部渗透压增大而引起极膜层和后极泡膨大。孢内渗透压增大的原因现有两种看法：一种看法认为，孢子壁上有特殊的跨膜水道，让孢外的水进入，使孢内压力增大，引发发芽。主要证据来自于对按蚊微孢子虫(N. algerae)的研究，此孢子有类似CHIP28的水孔蛋白(aquaporin)，它能特异地携带水穿过孢原质膜。脑炎微孢子虫属微孢子虫Encephalitozoon hellem孢原质膜的超微结构显示其表面大量粗糙颗粒，可能就有水孔蛋白。从兔脑炎微孢子虫(En.cuniculi)的基因组中也预测到一个特殊水通道的功能基因，可能与产生向孢内流动的快速水流有关，这对极丝放射和孢原质注入细胞都是非常重要。另一种看法认为，孢内海藻糖降解为葡萄糖和其他相关的代谢是引起孢内压力增大的重要原因。对按蚊微孢子虫的研究发现，孢子发芽后孢内海藻糖浓度下降，葡萄糖上升，因此认为海藻糖的降解使孢内摩尔浓度上升，促使水分进入孢内，孢子内压上升。 此外，适当浓度的离子、pH值改变等在发芽中的作用也不可忽视。如微孢子虫Spraguea lophii孢子体外发芽时，Ca2+进入抱内是活化发芽的重要条件，Ca2+的缺失会抑制孢子的发芽。总之，孢子内部压力的增高是孢子发芽的动力源，在此压力下，极丝从孢子壁最薄的部位—固定板处破壳而出，瞬间完成极丝外翻。极丝外翻时，极丝蛋白FTP3不断地聚合生成并包裹于极丝外，同时极膜层进入中空的极丝，后极泡膨大，不断产生的压力将极膜层和核压入极管中，尽管极丝较细，但弹性很好，能允许比它更大的孢原质团快速通过。一般认为，极丝通过瞬间放射时产生冲力刺穿细胞膜。 2.2 自发感染 西蜂微孢子虫等微孢子虫(Nosema)属的孢子有二型现象。一种孢子较大，孢壁厚，极丝圈数多，较长，称长极丝孢子，寄主排泄到环境中的主要是这类孢子，有较强的抗逆性，亦称为环境孢子(environmental spore)；另一种体型较小，孢子尾部常内凹，孢壁薄，极丝圈数少，短，称短极丝孢子。短极丝孢子在细胞内发育成熟后，会自发发芽，可侵染所在细胞或相邻细胞，称之自感染孢子(autoinfection spore)。目前对短极丝孢子自发发芽的机理还不清楚。 2.3 依赖于细胞吞噬的感染 微孢子虫还有一种依赖于细胞吞噬的侵入机制，已在研究脑炎微孢子虫属微孢子虫 En.intestinalis和En.hemell的侵染过程发现。此前，在蓖麻蚕微孢子虫等的研究中发现有游走体可能是通过寄主细胞的内吞或与寄主细胞膜融合而侵染，即二次感染体。但对这种侵染方式还有很多疑问。 3 微孢子虫的细胞内增殖与侵染特异性 蜜蜂微孢子虫生活周期与其他许多微孢子虫相似，孢原质进入寄主细胞后，开始在细胞质内无性繁殖，先后经历裂殖生殖和孢子生殖两个阶段。在裂殖阶段，孢原质转变成裂殖体，再分裂成裂殖子之后进入孢子生殖阶段：形成母孢子，此时在其质膜外层有电子致密物质沉积；母孢子分裂一次形成两个孢子母细胞，此时孢子内部结构逐步形成，最终转变为成熟孢子，成熟孢子再从破裂细胞中释放出来。由于对微孢子虫生活史的总结是来自于不连续的静态的显微观察，对一些细节仍存在不同的看法。 寄主昆虫的肠道和细胞内环境影响着微孢子虫的侵染特异性，相似的内环境则可能存在着相似的微孢子虫寄生。如蝗虫微孢子虫(N. locustae)对90多种蝗虫均有感染性，家蚕微孢子虫(N. bombycis)对40多种鳞翅目昆虫均有感染性；而另一些微孢子虫有较强的侵染专一性和组织侵染特异性，如内网虫属微泡子虫(Endoreticulus)主要侵染中肠组织，西蜂微孢子虫主要侵染的也是中肠组织，偶有在血细胞等其他组织发现。在人工接种的情况下，西蜂微孢子虫能侵染中蜂，中蜂微孢子虫也能侵染西方蜜蜂，即两种微孢子虫能交叉中蜂和西方蜜蜂。而我国许多地区两种蜂同(区)场饲养很常见。此外，西蜂微孢子虫经人工接种还能感染熊蜂Bombus feridus，推测西蜂微孢子虫对蜜蜂科的其他昆虫可能存在更广泛的感染性。 4 由孢子蛋白入手探索其侵染机制 孢子发芽是微孢子虫侵染的首要步骤。因此，理论上讲，如果能找到安全的孢子发芽抑制方法，就可以阻断侵染的发生。虽然已知不少外界因子(如K+、Na+离子等)能激发或抑制孢子发芽，但受生物内环境限制而难于发挥作用。而孢子蛋白作为基因的产物，较为保守，可作为药物的理想靶标，这是人们热衷于极丝蛋白等孢子蛋白研究的重要原因之一。 体外试验表明，兔脑炎微孢子虫(En. cuniculi)，En.intestinalis，En.hellem 3种孢子外孢壁的单抗能显著抑制孢子对细胞的侵染率。表明，单抗可能中和了孢子表面的一个或更多的抗原决定簇，从而影响了孢子发芽，或孢子发芽了，但在细胞内的增殖受到了影响，因为此单抗还能识别发育过程中的母孢子。另有研究表明，家蚕肠球菌(Enterococcus)的一种外分泌蛋白体能显著抑制家蚕微孢子虫孢子体外发芽，抑制率达65.95％～70.08％。去除表面抗原的家蚕微孢子虫其致病性及发芽率明显降低。说明微孢子虫孢子表面有发芽关键蛋白，当它们受到抑制(如抗体的中和)或破坏时，孢子发芽和侵染会受到显著影响。通过固相双向电泳技术对侵染性差异的家蚕微泡子虫蛋白的比较，已筛选到几种可能与发芽相关的孢子表面蛋白，该研究小组正进一步用单抗技术筛选孢子表面发芽关键蛋白，深入发芽关键蛋白的结构、功能及表达等问题将为揭示微孢子虫的发芽侵染机制和微孢子虫的防治打下坚实基础。引自《中国养蜂》2005，56（12） 1567