对蜜蜂咽下腺分泌生理研究的进展浙江大学动物科学学院 蔡芳 陶挺 陈盛禄 苏松坤 摘要：咽下腺是蜜蜂(Apis)工蜂合成和分泌蜂王浆的主要腺体，其活力高低直接影响蜂王浆产量。本文就咽下腺分泌活力与工蜂发育日龄的关系、分泌蛋白在蜂群中的传递规律、分泌细胞学研究、影响咽下腺发育的因素、分泌活力检测方法和分泌蛋白的分子生物学研究进展作一综述。 关键词：蜜蜂；咽下腺；分泌生理 咽下腺分泌物蜂王浆是工蜂饲喂蜂王、幼虫的主要食物。咽下腺是一对葡萄状的泡状腺，分别盘绕在工蜂头部前额腔两侧。近年来，对蜜蜂咽下腺分泌蛋白、分泌生理及分子生物学的研究成为热点，在此作一综述。 1 咽下腺蛋白的分泌及其在蜂群中的传递 同位素示踪技术被成功地运用于蜜蜂咽下腺蛋白的合成、分泌及其在蜂群内个体间传递的研究。Takennaka(1990)利用体外器官培养测定工蜂一生中咽下腺的蛋白合成情况。通过SDS-PAGE，发现咽下腺分泌物有22条条带，分子量范围为3.0×104 Da到19.0×104Da。从王浆蛋白中分离出20条条带，分子量范围为3.5×104Da到9.5×104Da。王浆蛋白图谱与咽下腺分泌蛋白相似，从咽下腺中检测出葡萄糖氧化酶、淀粉酶、α-葡糖苷酶，但在王浆中只发现葡萄糖氧化酶。 Crailsheim(1990) 采用14C标记的苯丙氨酸注射到8日龄哺育蜂和采集蜂体内，90 min后，分析咽下腺蛋白，发现哺育蜂比采集蜂结合更多的14C到蛋白中，结果表明，蜂群内成年蜂之间的交哺作用对蛋白质的分布起重要的作用。Crailsheim(1991)从蜂群中抓出8日龄工蜂，给它们注射14C-苯丙氨酸，观察哺育蜂咽下腺蛋白分泌物在蜂群中的分布。两小时后，40%的放射性活力在它们头部。把蜜蜂放回蜂群，该蜂群有400～800只工蜂和幼虫，在接下来的ll h，哺育蜂的放射性活力水平下降；一小部分被传给蜂王，而更多传给幼虫，近1/4的放射性活力无法从哺育蜂中恢复而以蛋白接合的方式被传给其它工蜂；近20%的工蜂接受放射性标记的食物。哺育蜂还饲喂青年雄蜂。 Crailsheim(1992) 从两个正常蜂群中抓出100只哺育蜂，用14C标记的苯丙氨酸注射哺育蜂。这些蜂的一小部分被独立分开，其余部分放回蜂群；第二天，测定过夜后的同位素分布。在独立分开组中，过2 h 和8 h，在它们的咽下腺和身体蛋白中发现同位素。交哺的结果导致蜂群中注射过同位素的哺育蜂丧失同位素，1/2～l/3 的同位素分布在其他成年蜂身上，特别是青年蜂和采集蜂，这2群蜂中分别有10%和16%的工蜂含有同位素，其余的同位素分布到幼虫上。非常小的工蜂幼虫比大幼虫含有更少的同位素。进一步研究发现，与蜂群中的工蜂相比，关在笼内的工蜂体内和头部结合放射性标记的苯丙氨酸的量减少，咽下腺变小，与更老的蜂、更青年的蜂和相同日龄的工蜂关在一起的结果相似。Naiem 报道新出房工蜂被关在与已知日龄的陪伴蜂在笼内8 d，陪伴蜂每2 d 换一次，8 d 后，对试验蜂测定各种参数作为发育水平的标志，与6日龄陪伴蜂关在一起的试验蜂的发育状况好于单独、刚出房、或与其他日龄陪伴蜂关在一起的试验蜂。它们的咽下腺更大，蛋白质更多，胸部的蛋白含量更高，中肠蛋白水解的活力更强。结果表明，即使在人为条件下，食物的交流促进青年工蜂的发育。 2 咽下腺分泌细胞学 Kumar(1999)研究饲养在印度坎地加Panjab大学的东方蜜蜂(Apis cerana Fabr) 的7日至13日分泌王浆工蜂的分泌细胞的特性，按顺序分析了分泌物质的形态和细胞化学特性，有3种不同的分泌物形态：颗粒体、小球和包含在分泌物储存泡内的同源物质。细胞化学检测表明小的颗粒体和分泌物储存泡内的物质是蛋白质，小球和大的颗粒体是脂肪，而分泌细胞基础的一些大的小球包含糖元。 Moraes分别采用组织学、细胞化学、顺序隧道、膜联蛋白V和慧星检测方法，研究西方蜜蜂咽下腺细胞死亡的方式。腺体内细胞呈现编程性细胞死亡、坏死和程序性细胞液泡死亡方式的特征，发现哺育蜂和老采集蜂咽下腺细胞死亡的方式不同。 3 影响咽下腺发育的因素 3.1 蜜蜂幼虫信号激活咽下腺发育 Huang(1989) 研究报道，对每个试验蜂群用单层或双层网眼的纱网分成两部分，一边有幼虫，一边无幼虫。用体外生物检测方法测定各蜂群青年工蜂的咽下腺蛋白合成情况，有幼虫蜂群中工蜂蛋白合成的量明显高于无幼虫蜂群，结果说明，幼虫中的信号激活蛋白合成，这种信号不是一种高度易挥发的化学物质，也不是一种通过交哺作用在工蜂之间传递的物质。总蛋白内容物与咽下腺合成活力之间有相关关系，没有发育和肥大咽下腺合成蛋白的活力低于中等发育程度的咽下腺。 Mohammedi(1996)利用从西方蜜蜂雄蜂和工蜂幼虫的表皮分离出10种脂肪酸酯混合物，用这种混合物和两种单独含有分别加到糖中饲喂由处女王和刚出房工蜂组成的蜂群，饲喂幼虫信息素的第14日龄工蜂的咽下腺内容物显著高于对照组。分别单独饲喂乙基油酸酯和甲基软脂酸，提高咽下腺蛋白内容物的阀值浓度分别为120和271幼虫当量/工蜂/天。 3.2 保幼激素直接影响咽下腺发育Sasagawa(1989) 报道蜜蜂工蜂的日龄行为多态型及保幼激素(JH)对它的调控。实验表明保幼激素与腺体活力有直接关系。Sasagawa(1989)报道蜜蜂成年工蜂劳动分工的激素调控：methoprene对蜜蜂咽侧体和咽下腺及其α-葡糖昔酶活力的影响。给蜜蜂工蜂注射 methoprene(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0)，发现其咽侧体的发育受抑制；最低剂量刺激咽下腺的发育，而最高剂 量抑制咽下腺的发育。蜜蜂咽下腺α-葡糖苷酶活力的最高峰在正常蜜蜂中出现在老(采集)蜂阶段，通过注射0.1～10.0的 methoprene 的工蜂在1～2星期内α-葡糖昔酶活力达到最高峰。把0日龄用 methoprene处理的工蜂介绍到正常蜂群中，守卫蜂和采集蜂出现的日龄分别比正常对照蜂群早 7 d 和 5 d。2周龄执行不同任务的工蜂血液中 JH合成率和水平明显不同，泌蜡蜂和贮存食物蜂的JH水平低，而守卫蜂和摈葬蜂的JH水平与采集蜂一样高。咽下腺大小与工蜂日龄和JH生物合成率成反相关。然而，与采集蜂日龄和JH水平一致的战斗蜂(从蜂群飞出并螫刺)的咽下腺更大。 3.3 蜂群状况对咽下腺发育的影响 Ohashi 报道蜜蜂失王群中工蜂咽下腺的作用灵活性。结果表明，工蜂咽下腺细胞的作用具有灵活性，根据蜂群条件需要，能够保持与哺育蜂一样的功能。Liu(1990) 报道蜜蜂孢子虫感染及烟曲霉素处理后工蜂的咽下腺分泌颗粒的超微结构变化。健康工蜂的咽下腺有许多电子致密分泌颗粒，感染蜜蜂孢子虫后，这些颗粒变大并失去电子致密区，拥有一个由许多更小颗粒组成的中心核区和轻电子致密的边缘区，有些边缘区有结晶结构。感染蜜蜂用烟曲霉素处理后，咽下腺的分泌颗粒变大、电子致密变轻，但颗粒的内容物是均匀的，有些颗粒也有部分的结晶。患病蜜蜂和烟曲霉素处理蜜蜂的分泌颗粒的超微结构变化可能与腺体的分泌活力变化有关。感染了孢子虫的工蜂的咽下腺分泌物发生了明显的变化。Omar(1992)在试验室检测饲喂“Apitol”(用于阶段大蜂螨的蝇毒硫磷的一种剂型)对蜜蜂的影响，发现喂制剂增加蜜蜂的死亡率，特别是连续喂制剂，咽下腺的发育减缓，直肠的内容物和酸度增加。 3.4 不同蜂种咽下腺发达程度不同 Yousif(2000)研究埃及不同蜜蜂品种的杂交后代工蜂的咽下腺发育，发现喀尼阿兰的F1代咽下腺最发达，而高加索的F1代显示最小的杂交优势。“浙农大1号”意蜂品种的工蜂的咽下腺泌浆高峰期持续时间平均比原意长7～8 d，这可能是“浙农大1号”意蜂王浆产量高于原意的重要原因之一。 4 检测咽下腺分泌活力的方法 Hassanein 等(1952)测定咽下腺腺泡大小作为活性高低的标志；Pickard(1983)提出把王浆腺的重量作为其活性高低的指标；Brouwers(1982)采用同位素示踪结合组织培养法测定了了西方蜜蜂王浆腺体外合成蛋白质的速率，并以此作为王浆腺的活性指标。 Huang(1990)报道一种简便的活体估测蜜蜂咽下腺活力的方法。采用放射性14C-L-亮氨酸被直接注射到蜜蜂的血腔内，随后在蛋白质合成中被结合到咽下腺内。经过2 h 的培育，检测腺体结合放射性亮氨酸的数量，并作为腺体合成活力的指标，这种技术简便、快速、可靠。 5 咽下腺分泌蛋白分子生物学 TaLenaka(1990) 报道蜜蜂工蜂一生中葡萄糖氧化酶活力和葡糖酸形成数量的变化。咽下腺中葡萄糖氧化酶的活力在工蜂出房后迅速增长到第7 d，后开始下降到第15 d，之后又上升，到第23 d 时达到最大活力。咽下腺葡糖酸合成的数量变化规律与此相似。第一个高峰与哺育阶段王浆分泌活跃相吻合，第二个高峰发生在采集酿制蜂蜜阶段。ohashi 等报道西方蜜蜂咽下腺α-葡糖苷酶的cDNA分子克隆和基因表达分析。0hashi(1999)报道西方蜜蜂工蜂咽下腺中淀粉酶和葡萄糖氧化酶随日龄变化而出现不同的表达丰度。 蜜蜂咽下腺是分泌蜂王浆的主要腺体。Hanes(1992)率先报道了蜜蜂王浆主蛋白的分离及特性，随后，对西方蜜蜂(Apis mellifera)的蜂王浆主蛋白基因进行了一系列的克隆和分析，目前已经克隆王浆蛋白家族的9个成员。我国科技工作者在中华蜜蜂(Apis cerana cerana)王浆主蛋白基因克隆与分析方面也取得突破，已获得中华蜜蜂5个王浆蛋白基因的cDNA全长序列。蛋白质组学技术也被应用到王浆蛋白研究中，Scarselli R 等用蛋白质双向电泳、质谱、de novo测序技术研究了咽下腺分泌蛋白的蛋白质组。 科技工作者开始利用已克隆获得的蜂王浆主蛋白基因进行真核表达及表达产物的功能研究，以揭示王浆蛋白的生物学功能。随着分子生物学研究的深入，蜂王浆蛋白的生物学功能将最终得到诠释，为人类的健康事业做出新的贡献。