蜜蜂种质的保存黄文诚 译 很多人知道，美国农业部贝尔兹维里蜜蜂研究室的主要研究方向是蜜蜂病虫害、非洲化蜜蜂以及蜂群防御与报警机制的研究。然而，1995年该研究室接受了一项新任务，研究蜜蜂种质或生殖细胞的保存。美国国会指示，美国农业部农业研究部门应制定国家遗传资源规划，保存重要农业物种的遗传多样性。农业研究局在若干地区有保存作物品种的悠久历史。但是，这项指令要保护动物，包括昆虫也要保存。选择蜜蜂作为三种模式昆虫之一，它代表膜翅目的有益昆虫，另外两种昆虫是家蝇(双翅目)和粉红棉铃虫(鳞翅目)都是重要害虫。有些研究小组已在有效利用寒冷和自然滞育(冬眠)来保存蝇类和毛虫(鳞翅目幼虫)害虫，但是，对昆虫来说蜜蜂有一种独特的方法，即人工授精。 一、人工授精和生存率 目前，蜜蜂是具备人工授精或器械授精完善方法的唯一昆虫。自从20世纪20年代发展起来的蜂王人工授精设备是尖端的和多种多样的，其中包括用于采集大量精液的哈勃氏注射器。本计划的目标之一是研制一种冷冻精液的方法。测试精子的存活率(这种方法现在应用于许多物种)对研究有很大帮助。精子用两种不同的颜色染色，绿染料与精子头内的DNA结合，红染料只在细胞死亡时进入头部。精于头呈绿色的是活的，红色头是死的。我们计算若干个样本，每个样本100个精于细胞，求平均数。采用这种染色技术，我能试验多种冷冻处理，并直接评价精子。以前研究蜜蜂精液冷冻保存的研究人员，必须等待用处理的精液给蜂王授精，蜂王开始产卵，卵成熟到足以看出是否在工蜂房里的全部卵是工蜂(受精的)，还是蜂王在不适当的位置产了雄蜂(未受精卵)。应用生存率染色技术，能够回答一些基本问题。用已知活精液水平，从0%(全部是死精子)到100%(新鲜精液)的精液样本，就能说明用大于50%活精子授精的蜂王将产正常的工蜂幼虫，至少持续产一个季度。用低于50%活精于授精的蜂王，在工蜂房里产不同程度的雄蜂。作为蜜蜂育种专家使用此项实用技术，50%活精子是冷冻保存精液精液样本必须达到的存活率阀值。采用冷冻后存活一半以上的精于给蜂王授精，就能在一个夏季培育新蜂王，这样长的时间足以在育种程序中扩大特殊的种群。在设置存活率阀值时，研究人员还发现蜜蜂精子容易受到处理的伤害。精液是很浓的液体，为采集足够一次授精用的精液或者想要保存采集来的大量的精液，使用注射器进行人工授精时，要用力吸取精液，这就大大降低了精液的存活率。有些蜜蜂育种家采用从多只雄蜂采集精液的方法，将精液在稀释液里混合，然后再用离心浓缩。从前发表的文章，离心的速度和时间对精子的存活率影响大，速度快会损伤精于。新发表的方法，采用对精于比较温和、较低的速度，但是浓缩精液需要的时间较长。 二、遗传力和生存率 阿根廷的安德雷博士在执行养蜂发展综合计划，也采用这种精子生存率测定法来确定雄蜂之间的自然变异。发现雄蜂的自然变异很大，这种特殊的遗传计量单位通称为遗传力。结果表明，精子生存率至少部分受遗传的影响，在遗传育种计划中，从选择雄蜂改善精子的生存率可以定为目标。 三、精于冷冻保存 在液氮中冷冻生物组织，必须保护细胞不受损伤。与稀释液一起，将细胞保护剂加到精液里。稀释精液的冷冻和解冻的速度对精子的存活也很重要。安德雷博士等试验了多种曾经用于蜜蜂精液的溶液，以确定其中那种最适宜作为储存精液的稀释液。有数种含盐和糖的生理盐溶液，pH为7和9，重量渗透压浓度(溶液中渗透压活动颗粒的总数)在350和500，精于在这样的溶液中是稳定的，并且保持活力。进行一系列不同稀释液、若干常用冷冻保护剂以及各种冷冻和解冻速度的试验，并且对精液样本直接进行测定。最终精液样本的存活超过了50%的阀值水平。同样也检测了新鲜精液的稀释液和冷冻保护剂对授精蜂王的影响。在夏季，计划将所有这些信息综合在一起，形成采集和冷冻精液的标准方法。我们将用冷冻和解冻的精于给一组蜂王授精，评价它们所产的工蜂幼虫的质量。 四、在室温条件下的储存 从人工授精的长期经验，得知将采集的精液存放在室温下是可能的，但不知是否能长期储存。因此，将采集的精液，密封在毛细管中，放在黑暗房间里，室温储存1年。令人喜悦的是，精子生存率至少在8周内保持在高水平，然后慢慢下降。少数样本没有污染，密封很好，在储存1年后发现它们的生存率高于50%的阀值。即便只能将精液保存数周，这种方法或许能给育种家某些自由，在有大量雄蜂时采集精液，保存到有了蜂王。不幸的是，试用室温下储存1～8周的精液给蜂王授精，大部分蜂王产的是雄蜂卵。精于是活的。但是不执行它们的任务。后来经过多次试验，研制出一种稀释剂刚好在授精前与精液混合，它将刺激精于达到正常的活动水平，在夏季将测试这种方法，评价产卵的蜂王。 五、蜜蜂卵的冷冻保存 研究计划包括蜜蜂卵，卵3日内发育成胚胎。开始这项研究时，已经发表了在液氮中冷冻果蝇胚胎的成功方法。很幸运是，能与研究者之一的田纳西州立大学的彼得·梅休尔博士一起工作。这项措施已应用到其他昆虫的胚胎。蜜蜂生物学使胚胎保存成为挑战，因为必须个别地采集卵，它们太小在处理它们冷冻时比较困难。现在，有一套良好的措施采集卵，并能让它们在孵化器中 100%孵化。在研究果蝇过程中，研究人员发现采用一定发育阶段的胚胎，在冷冻后能得到较高的生存率。这对蜜蜂胚胎同样有用，48小时的蜜蜂胚胎最能耐受冷冻。我们用精液试验的冷冻保护剂，同样适用于蜜蜂胚胎。为了使冷冻保护剂进入胚胎，必须将卵的外壳除去，用温和的漂白(Clorox)溶液除去卵壳。然而用于果蝇和蚊虫胚胎的溶剂会杀死蜜蜂的胚胎。因此，研究停留在这一阶段，能够保存卵要比冷冻精液更令人激动。如果这些胚胎能孵化，培育到1日龄。将它们移至无王群，按照标准方法培养蜂王将是件容易的事情。这样培育出的蜂王能自然交配，不需要人工授精，也能培育出选作保存的遗传种群的雄蜂。 六、自然储存的蜂王如何 本计划的最终日的是，进一步地了解蜂王为什么能在相对高的温度下储存精液多年，精子仍然存活，能给卵授精。研究人员相互协作，开始了一项大胆的计划，试图发现蜂王受精囊里发生了什么，以及雄蜂对自然储存的精于可能有什么影响?有一些早期的资料，若干种抗氧化剂能保护细胞避免随时间降解，它们可能以较高的水平出现在受精囊中，并随精子存在精液里。在过去的几年里，Evans博士参与蜜蜂基因组测序计划，现在有一个蛋白质组实验室从事蛋白质的大规模研究，特别是蛋白质的结构及其功能，使人们能解剖特殊组织，例如精于或处女王的受精囊，分离其中的蛋白质。蛋白质组实验室然后能鉴定这些蛋白质的性质，并能从基因组项目找出与其匹配的蛋白质基剧顺序。因为蛋白质在许多细胞变化过程中是关键的物质，可以使我们了解受精囊里发生的事情。这是一项令人激动的尖端科学，我们衷心希望能获得一些解答，或者得到另外的种质保存的手段。