摘要：美洲幼虫腐臭病是目前危害蜜蜂幼虫生长的主要细菌病，不合理地使用抗生素防治该病是导致蜂产品抗生素残留的重要因素。本文介绍了它的病原(Paeniballus larvae subspecieslaevae)和流行病学特征，并就目前检测美洲幼虫腐臭病痛原和防治该病的研究进展做一综述。

关键词：美洲幼虫腐臭病 幼虫芽孢杆菌 检测防治

美洲幼虫腐臭病(American foulbrood)，简称美幼病，是侵害蜜蜂幼虫的一种细菌性病害。被感染的蜜蜂幼虫平均在孵化后12．5天表现出症状，首先体色明显变化，从正常的珍珠白变黄、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同时虫体不断失水干瘪，最后成紧贴于巢房壁的、黑褐色的、难以清除的鳞片状物。该病于1907年确定，目前广泛发生于温带与亚热带地区的几乎所有国家，给这些国家的养蜂业带来了严重的经济损失。我国于1929～1930年间引进日本西方蜜蜂蜂种时将该病带入，如今受其影响较严重(陈盛禄，2001)。美洲幼虫腐臭病的病原具有极强的生命力，在曾经暴发美幼病的养蜂主产区普遍存在，因此，多数蜂场为防止美幼病的发生，采用饲喂抗生素的方法，这是造成蜂产品中抗生素残留的重要因素，如果用药剂量和时间稍不注意，就会引起抗生素残留超标。研究美幼病的病原检测方法和防治新技术对于准确对症用药，采用非抗生素药物防治美幼病，减少或避免抗生素残留具有重要意义。

1 病原

美洲幼虫腐臭病由幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae subspecies larvae)引起。它是一种革兰氏阳性细菌，在一定条件下能产生芽孢，而且它产生的芽孢很有特色，一般细菌的芽孢外面只有4～5层结构包围，但是幼虫芽孢杆菌的芽孢却有7层结构包围，这种特殊的构造使得幼虫芽孢杆菌的芽孢具有特别强的生命力，而且它对热、化学消毒剂等都具有极强的抵抗力，在热、干燥等恶劣环境下至少能存活35年。

目前已知幼虫芽孢杆菌的基因型至少有5种，且不同基因型的细菌株系所导致的美洲幼虫腐臭病的流行情况略有不同(Genersch E 等，2003；NeuenJorf S 等，2004)。不同基因型的幼虫芽孢杆菌可以通过PCR技术和16SrRNA的编码基因的限制性酶切片段多态性加以区别鉴定。

2 流行病学特征

美洲幼虫腐臭病病害的流行是由幼虫芽孢杆菌的芽孢引起的，而不是它的营养体。原因可能是蜜蜂幼虫的食物具有一定的杀菌作用，比如花粉和蜂王浆中的一些脂肪酸和抗菌肽物质，它们对幼虫芽孢杆菌的营养体有抑制和杀灭的作用(Manning R，2001；Bililtova K 等，2001；Bachanova K 等，2002)。

芽孢被蜜蜂幼虫取食后，就在幼虫的中肠萌发，然后穿过小肠组织，开始快速繁殖，最后杀死蜜蜂幼虫。对芽孢的萌发来说，日龄越小的幼虫其萌发条件越好，但对营养生长来说，则是老熟幼虫最适宜。这是因为芽孢的萌发需要一个低氧压的环境，而生长、繁殖及产生芽孢则需要高氧压的环境(陈盛禄，2001)。所以不同虫龄的蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌的敏感性差异非常大，1日龄的幼虫对幼虫芽孢杆菌高度敏感，通常只要不足10个芽孢就能使之患病，但是侵染2日龄以上的幼虫，则需要数以百计的芽孢(Evans，2004)。另外有研究发现，成虫蜜蜂对幼虫芽孢杆菌有抵抗作用，原因是它们的中肠能产生一些可以抑制幼虫芽孢杆菌生长和芽孢发育的物质。

幼虫芽孢杆菌在蜜蜂群内的传播可以是水平的，即通过错投和盗蜂传播，也可以是垂直的，即通过分蜂传播，而在群间的传播则主要是通过垂直传播(Fries I 等，2001)。幼虫芽孢杆菌的这种传播方式使得它成为蜜蜂一种传染性极强的疾病。由于芽孢只要在适宜的环境下就能萌发，所以美洲幼虫腐臭病的发生没有一定的季节性，病害能在一年中的任何一个有幼虫的季节都有可能发生，但是一般在夏、秋季节发生的相对较多。气候和蜜源对其发生有一定的影响，病群在优质蜜源大流蜜期到来时，病情会减轻，有些甚至能“自愈”，其原因主要有：①芽孢可能被采进的花蜜稀释，从而降低了幼虫从食物中接触芽孢的机会；②花蜜的充盈刺激了蜂群中内勤蜂的清洁行为，内勤蜂发现和消除病虫的能力增强；②刚采回的花粉作为幼虫的食物，在一定程度上也减少了幼虫被芽孢侵染的机会(Fries I 等，2001)。

3 病原鉴定

对于幼虫芽孢杆菌的鉴定，早些时候一般先对其进行分离培养，然后进一步通过生化手段进行鉴定。但是由于幼虫芽孢杆菌芽孢的生长比较特殊，它需要复杂的营养，在普通培养基上不能萌发也不能形成芽孢，需要专用的培养基，而且它的生长速度很慢，所以这样的方法显然比较花时间，而且还要依赖后面一系列复杂的生化方法。

于是就有人试图发展一种选择性培养基，希望通过分离培养就能鉴定出幼虫芽孢杆菌，而不再需要接下来的生化鉴定。在这些探索中比较成功的是Alippi在1995年发明的一种半选择性培养基。他在培养基中加了萘啶酮酸和pipennedic酸，由于幼虫芽孢杆菌的生长比较特殊，它可以在加了萘啶酮酸和pipeMedic酸的培养基上生长，而其他大多数细菌则不能，从而可以将它们分离开。虽然这种方法相对比较简便，但是却不可避免的存在一定的假阳性现象。在此基础上，在1999年，Govan V A 等报道可以使用PCR技术来分辨培养时出现的真假阳性，从而增加了上述方法的可信度间。

1999年，Stahly等从NE株系的幼虫芽孢杆菌中分离得到了幼虫芽孢杆菌噬菌体的致命性突变体PPLlc，并且证实幼虫芽孢杆菌的几乎所有株系都对PPLlc敏感，而其他细菌对PPLlc有抗性。这样就使幼虫芽孢杆菌培养后的鉴定变得更加简单方便了，只要看是否有噬菌斑的出现就可以了。

但是上述这些方法的使用都需要幼虫芽孢杆菌的培养，而前面已经提到幼虫芽孢杆菌的培养是比较麻烦的，PCR技术的使用就克服了这一困难，它可以不需要经过培养，就能直接对蜂蜜中的芽孢进行鉴定。

2001年，Dobbelaere W等发展了一种以16Sr—RNA的编码基因为引物的PCR技术来鉴定幼虫芽孢杆菌的方法，实验证明该方法快速、可靠，在4小时内就能做出正确的诊断。此后，Piccini C 等(2002)、Bakonyi T 等(2003)、AlipPi A M 等(2004)也相继报道了可以使用PCR技术对蜂蜜中的芽孢进行快速直接鉴定。通过这些PCR技术的改进和引物的改良，现在我们已经可以在蜜蜂幼虫尚未发病的时候检测出低含量的芽孢，从而能够防患于未然，控制美洲幼虫腐臭病的大规模流行。

4 防治

由于美洲幼虫腐臭病的存在历史已经比较悠久，而且它的传染性极强，破坏力很大，所以如何来有效的防治它是人们一直以来都非常关心的问题，相关的研究报道也很多，而其中研究最多的莫过于抗生素的使用。

早在1944年 Haseman 等就介绍用硫胺噻唑来治疗美洲幼虫腐臭病，1951年 Gochnauer 等报道土霉素治疗美洲幼虫腐臭病非常有效，而后的几十年人们就普遍使用土霉素来防治美洲幼虫腐臭病。但是近些年来人们越来越多的遇到了使用土霉素治疗美洲幼虫腐臭病效果下降的情况，有时甚至完全失效，后来证实是幼虫芽孢杆菌对土霉素产生了抗性。

如何控制已经对土霉素产生了抗性的美洲幼虫腐臭病成为蜂病防治的新课题。很多人将注意力投向了使用其他的抗生素来代替土霉素。2001年，Feldlaufer M F 等报道盐酸林可霉素(lincomycin hy—drochloride)能有效地控制美洲幼虫腐臭病，而且对蜜蜂的生长没有毒性间。2002年，Elzen P 等报道泰乐菌素(tylosin)对控制有土霉素抗性的美洲幼虫腐臭病很有效，而且它对蜜蜂的生长也没有毒性。然而这些候选抗生素的发现或许会在一定时期内有效，但却不能从根本上解决问题，因为新的抗生素的使用同样还存在会使病原菌产生抗性的问题。

此外，抗生素的使用还有另外一个普遍的问题，就是抗生素会在蜂蜜中残留，从而影响蜂产品的质量。相关的研究报道也很多，目前主要是通过HPLC—MS/MS方法来鉴定和测量蜂蜜中残留的抗生素(Benetti C 等，2004；Ortelli D 等，2005)。最近，Kochansky J 报道泰乐菌素在蜂蜜中的降解很慢，它在34℃环境下转变为脱炭霉糖泰乐菌素(desmycosin)的半衰期大约是4个月，而脱炭霉糖泰乐菌素在蜂蜜中相当稳定，在处理9个月以后，两者在蜂蜜中的总量只减少了一点点。所以在使用泰乐菌素来治疗美洲幼虫腐臭病一定要小心它在蜂蜜中长期残留的问题。

既然抗生素的使用存在上述两个很难解决的问题，所以我们不能长期依赖抗生素来防治美洲幼虫腐臭病，于是就试图去寻找其他药物和途径。2001年，Bilikova K 等报道分离自蜂王浆中的一个多肤片段可以做为抑制美洲幼虫腐臭病的潜在因子。2002年，Bachanova K 等通过多聚酰胺凝胶上细菌生长抑制试验证实了蜂王浆中的抗菌肽抑制幼虫芽孢杆菌生长的活性。2004年，Gallardo G L 等报道分离自蜂房花粉中两个真菌株系的L—细交链孢菌酮酸(L－TenuMonicacid)表现出了对幼虫芽孢杆菌生长的特殊抑制能力，其最小抑制浓度为32ug/mL，比现在普遍使用的土霉素的最小抑制浓度小。2004年，Aonstein K A 等报道蒜素(Allicin)具有抑制幼虫芽孢杆菌生长的潜力，能在一定程度上减少美洲幼虫腐臭病的发生。

除了使用药物外，还可以辅助使用其他一些途径。2001年，Del Hoyo M L 等就报道通过搬运感染美洲幼虫腐臭病的蜂群到新的蜂场能够减少其芽孢的携带量。同年，Spivak M等报道有卫生行为的蜂群抵制美洲幼虫腐臭病有很大作用，有卫生行为的蜂群感染美洲幼虫腐臭病的机率相对较小，而痊愈的机率则相对较大，而且产生蜂蜜的量也相对较多。

5 展望

随着幼虫芽孢杆菌对土霉素抗性的日益增强，迫切需要寻找新的药物来代替，或者采用有效的饲养管理和育种技术来控制美幼病的发生。虽然相关的研究比较多，但是到目前为止还未得到大家普遍公认的安全高效的抗菌药物，土霉素仍然是目前广大蜂农普遍使用的抗菌药。所以如何有效地筛选出安全高效的蜂用抗菌药物，并研究出其最佳的用药时间、用药剂量、用药方法，从而制定出一套科学的规范的方案对生产实践具有重要的意义。另外，由于中草药在中国的独特地位，加上它长期使用不会产生抗性的优良特性，我们可以尝试着寻找有效的中草药来防治美洲幼虫腐臭病。

引自《中国蜂业》2007（8）