蜜蜂人工授精技术研究进展及应用进展

摘要：从国内外探索研究蜜蜂人工授精技术发展进程，人工授精技术对蜜蜂育种技术发展的影响，人工授精技术在蜜蜂育种工作中的应用以及蜜蜂人工授精技术的应用前景等4个方面进行了阐述，使人们对该技术能够进一步加深了解和更好地发挥作用。蜜蜂人工授精技术的成功应用，推动了蜜蜂育种技术的发展，其重要性在于为蜜蜂细胞学研究、遗传学研究和育种工作中原良种保存繁育、单群选择、近交系、自交系、纯系的培育以及大规模的杂交组合配制等提供了可靠高效的实验手段。关键词：蜜蜂；人工授精技术；研究应用

1 蜜蜂人工授精技术的发展历程

1.1 国外对蜜蜂人工授精技术的研究

文献记载，人类在200多年以前开始探索蜜蜂人工授精技术。18世纪到19世纪初，人们探索蜜蜂人工授精的方式方法比较杂乱，有人把雄蜂精液滴在蜂王的蛹或成虫上，也有人把雄蜂精液涂到未受精卵上，或者在蜂王体表的不同部位进行授精，但都没有成功。1814年瑞士科学家F.于北，最早进行蜜蜂人工授精试验，他用一种毛笔状的工具，把雄蜂精液涂抹在蜂王阴道口上，虽然这个尝试未能成功，但他的试验给后来人以有益的启示。1883年德国W.汪克勒设计了一个能插入蜂王阴道的注射针头，称其为“人工阴茎”，使用时装在一只注射器上。1887年美国N.W.麦克莱恩用木板制造了一个蜂王夹板，把蜂王固定在夹板的凹槽里，夹板外露出蜂王腹部末端几节，用一支皮下注射器和一枚加工过的针头采集雄蜂精液并进行人工授精。19世纪末还有人采用玻璃细管进行采精，精液用生理盐水稀释后给蜂王授精。同一时期，多个国家先后出现了用手或简单装置把蜂王固定住，一手拿着雄蜂，试图在人手的撮合下，使雄蜂和蜂王进行交配；后来，还有人把雄蜂精液滴入到性成熟蜂王打开着阴门里。进行这种“手持交配”经历了一个很长的时期，从19世纪末到20世纪50年代很多人都进行了这种试验。但是前苏联V.V.特里亚斯特经过多次认真试验后得出的结论是：无论采用哪种“手持交配”的方法，精于进入蜂王受精囊的数量都很少，其精子数量只有自然交尾的0.5％～2.0％，没有实用价值。此后，还有人把大量的雄蜂和蜂王囚禁在笼内进行交配尝试，都没有成功。1924年美国R L 沃森开始研究蜂王人工授精技术。他熟悉吹玻璃管技术，因而设计制造了微量注射器。1927年沃森设计成功了微量注射器和授精装置，把微量注射器安装在具有两向导轨的巴伯吸量管操纵系统上，再组装在体视显微镜台上，控制注射器的移动，蜂王固定夹板用橡皮筋固定在镜台的另一端，用解剖镊子张开蜂王的背腹板进行人工授精，结果取得了前所未有的成绩。因此，世界公认沃森为现代蜜蜂人工授精技术的创始人，这种技术又称之为蜂王器械授精。

1928年美国W.J.诺兰掌握了沃森的蜂王授精器械操作技术后，设计制造了拉开蜂王螫针腔的弹夹、背钩和腹钩，用玻璃管制作成了蜂王固定器。1930年美国H.H.莱德劳将二氧化碳通入蜂王固定器的管内作为麻醉剂，使蜂王麻醉，便于人工授精操作。1931年莱德劳制造出了一个马蹄形的弹夹，用以打开蜂王螫针腔。1933年莱德劳解剖了一些自然交尾后返回蜂巢的蜂王，他发现在蜂王阴道中部有一个舌状阴道瓣突的作用如同一个阀门，在它突起时完全关闭中输卵管的开口，对蜂王交配后防止精液外流和促使精于转移到受精囊中有重要作用，同时得出结论，人工授精针头必须越过阴道瓣突把精液注入到输卵管内。他用一个细金属环使阴道瓣突倒下，以露出中输卵管口。1944年莱德劳根据蜂王阴道内的特殊结构，制造了用于压低阴道瓣突的阴道探针，人工授精时让针头沿着阴道探针的背面顺利进入到蜂王中输卵管内。

20世纪30年代以后美国H.H.莱德劳、O.W.麦肯森、W.J.诺兰、W.C.罗伯茨、J.R.哈博、德国F.鲁特纳以及前苏联T.A.阿维季相等人对蜜蜂人工授精注射器、针头、蜂王麻醉器以及注射操纵装置等部件不断进行改进。

1944年美国W.C.罗伯茨等人发现蜂王有重复交配现象，蜂王须与6～9只雄蜂交配，认为对每只蜂王进行人工授精也须应用多只雄蜂的精液，才能达到与自然交尾相同的效果。1947年O.W.麦肯森发现，用二氧化碳作麻醉剂不仅对蜂王无害，而且还有消除发情反应和刺激蜂王提早产卵的作用。麦肯森还研究了隔膜式注射器，使人工授精的工作效率和成功率有了很大提高。

20世纪在世界上通用的麦肯森注射器就是以他的姓名命名的。麦肯森注射器研究成功后第3年，H.H.莱德劳设计了带有螺旋推进导轨并与麦肯森注射器配套的人工授精仪，莱德劳还首先使用了抗生素的稀释液，降低了细菌对精液的污染，提高了人工授精蜂王的成功率。20世纪80年代，德国F.鲁特纳等人又设计了一种结构精密、性能优良的多向导轨的人工授精仪。至此，蜜蜂人工授精技术、仪器设备以及理论研究，均达到相当高的水平。

2003年周玮译“小型万维手动 schley Ⅱ型人工授精仪的改进”。该文介绍了 schley 公司长期致力于人工授精仪技术的教学实践，面对众多不同需求的学生工作，促使 schley 公司设备不断改进创新，每次技术改进都使设备更加实用。对于严谨的蜜蜂育种工作者而言，蜜蜂人工授精技术是一项十分重要的技术，新型的 schley Ⅱ型人工授精仪它使得蜜蜂人工授精技术更加容易掌握。

1.1.1 雄蜂精液采集与常温贮存及授精技术的研究进展

1969年美国 Poole 和 Taber 在试管内贮藏雄蜂精液已经获得成功，在室温下能够将精液贮藏13个星期，1970年他们用麦肯森注射器采集精液，然后经过离心，火焰封口，在10～13℃下贮藏35个星期。并用麦肯森注射器采集精液，然后经过离心、火焰封口，进行贮藏。这种方法把精液从注射器转注到毛细管不仅要花费时间，而且使精液容易受到污染。1974年 Harbo 设计了一种能在可装卸的毛细管内注射器和贮存精液的注射器，毛细管的容量为50～60 μL，一端拉成针头。使用这种注射器就不需要将精液转注到贮藏管内，也不需要离心了，直接可进行人工授精。但是，它不能精确控制精液的移动，玻璃拉制的针头和推杆容易破损。1980年 Katanoglu ＆ Peng 把麦肯森注射器的针头加以改造，研究成功了一种新型注射器。这种新型注射器既可用来贮藏精液，又可进行人工授精。该注射器有良好的吸力，又有平衡压力的泄压孔，在拆装时不觉动毛细管内的精液柱，还有一个精确的控制机构。每个贮藏管盛装的精液可以给多只蜂王授精。同时他们还研究了采集雄蜂精液的漂洗技术。其精液采集器由漂洗精液的漏斗、聚乙烯连接管和精液采集管三部分组成。此漂洗方法操作容易而快速，无需借助于显微镜，在短时间内能够容易地采集到大量的雄蜂精液，它比传统的采集精液的方法更快速。

1.1.2 影响进入人工授精蜂王贮精囊内精子数量的研究

1944年以前人们认为蜂王只与一只雄蜂交配，因此早期蜜蜂人工授精仅以1.0～2.5 mm3(μL)精液来授精，其进入蜂王贮精囊内精子数量平均没有显著差别。

1951年 Trysko，1954年 Tdber，1955年 Woyke 发现蜂王在一次婚飞中可进行多次交配。1960年波兰J.Woyke发现一次成功的自然交尾后的蜂王在它们贮精囊内大约有5.34百万个精于。一个雄蜂可射出11百万个精子，几乎是蜂王贮精囊装载的2倍。然而用1 mm3精液约7.0百万个精子给蜂王人工授精时，仅有1.39百万个精子(20％)进人蜂王贮精囊，若使用8 mm3精液(约56百万个精于)给蜂王进行人工授精，进入蜂王贮精囊内的精于只有授精量的9.6％；1964年美国 Mackense 的试验为5.2％。因此，Woyke 建议凡仅一次人工授精的蜂王可用8 mm3精液。分作两次人工授精时，每次可用4 mm3精液，并认为进人蜂王贮精囊内的精子数多少取决于注射精液数量(Mackense，1964)。1960年 Woyke，1975年 Foti 发现自然交尾的蜂王，贮精囊较大的比贮精囊较小的含有更多的精子数。

1970年 Vesely 授精后的蜂王放在核群内自由活动，则它的输卵管内的精液会排除干净，可增加进入贮精囊的精子数。反之，蜂王被保存在纱笼内，则精液会滞留在输卵管内。1967年、1971年 Woyke 移植最小的幼虫培育出的蜂王，可增加贮精囊进入的精子数。1973年 Woyke ＆ Jasinski 授精后把蜂王保存在温度为34℃处，比把蜂王放回温度较低的哺育笼内进入贮精囊内的精于数量多。1974年 Woyke，Jasinski 和 Smagowska 发现，用相等数量的精液不同种系的蜂王进行人工授精，其贮精囊内的精子数目在统计学上意大利蜂)(高加索蜂的杂交王显著高于高加索蜂x卡尼鄂拉蜂的杂交蜂王。1975年 Foti，Grosu和D，agan 报道，蜂王在授精前后与30只工蜂一起关在笼内，其结果与蜂王保持在核群内一样。1976年 Woyke 和 Jasinski 当蜂王达到5～14日龄时可进行人工授精。

1979年 Woyke 报道了工蜂与蜂王的接近对人工授精结果的影响，总共96只蜂王，各以8 mm3精液进行人工授精，授精后的蜂王被分放到：1)在不伴有工蜂的哺育纱笼内；2)带有10个工蜂的哺育纱笼内；3)具有隔王片的哺育笼内；4)在两面具有隔王片的10 × 6.5×2.5 cm的雄蜂蜂笼内；5)在两面具有隔王板片带有巢脾的16× 6.5×2.5 cm的小隔离器内；6)在能够遮盖整个巢脾26×36 cm具有隔王板片的大型隔离器内。授精后48 h解剖蜂王，检查输卵管内精于的存在，并计算贮精囊内的精子数，其结果是：在纱笼里无论有无工蜂伴随蜂王，有5.6％的蜂王输卵管内有残留的精液；而保存在隔王笼或隔王器内的蜂王，有4.7％的蜂王输卵管内有残留的精液。在没有工蜂伴随的纱笼内的蜂王，其贮精囊内只有3.02百万个精子；在配备有隔王片的隔离器内的蜂王，其贮精囊的精子增加75％。因此，建议授精后的蜂王应放在有隔王片制造的隔王器内的巢脾上，直到它开始产卵。

1982年 Woyke 等人报道了伴随工蜂数量对保存的室外小交尾群的人工授精蜂王贮精囊内精子数的影响将160只蜂王全部用8 mm3精液授精，分别放入1脾和4脾两种类型的交尾箱内，每10群为一组，8 组每小群的工蜂数分别为：0只，50只，100只，200只，350只，500只，750只，1000只。小群放在室外，每天分别在8∶30，13∶00和20∶00用热电偶测定箱内外温度。授精2天后，20只蜂王中除了5只没有工蜂伴随的死亡外，其余蜂王的输卵管中仍留有残余的精液。几乎所有由100只或更多伴随工蜂的蜂王的输卵管内有残余的精液。1脾或4脾没伴有工蜂的小群中的蜂王贮精囊内精子量最少为1.4百万和1.2百万。50只有工蜂伴随的蜂王贮精囊内精于数量有两倍增加。达到2.6百万和2.7百万。工蜂数量增加到200只时，贮精囊内精子数量仅稍有增加，但当伴随蜂数增加到350只时，贮精囊内精子数达到3.7百万和3.6百万。为没有工蜂伴随的蜂王精子数的3倍，为有50只伴随工蜂的蜂王精子数的1.4倍，进一步增加工蜂数直到1000只，贮精囊内精于只有很少或没有增加，平均为3.95百万和3.68百万，差异不显著。伴随工蜂数量的增加，使蜂群温度从18.0 ℃升至31.6℃。为使蜂王贮精囊得到正常数量的精于，室外小核群中的人工授精蜂王至少要有350只伴随工蜂。

1982年美国A.B.伯尔坦等报道了少量多次授精与蜂王贮精囊中的精于量，用少量的稀释精液给蜂王多次授精，进人贮精囊中的精子数量显著多于等剂量的一次性授精（P＜0.01)。数次相同的小剂量授精，第二次授精进入贮精囊中的精于数量高于第一次，使用液态氮(-196℃)贮存的精液，在不同的两组试验中，第二次授精进入贮精囊的精子数分别占总数的77％和68％，用新鲜的稀释精液时第二次占61％。

1983年 Woyke 报道精于进人人工授精蜂王贮精囊的动态，授精1 mm3，2 mm3，4 mm3或8 mm3的蜂王，每只蜂王带伴随工蜂250只，放在34℃温箱内或不带工蜂关在无王群内，最初4 h授精量与有无工蜂对精于进入贮精囊的速度影响极小，为20～30万/h。授精1 mm3和2 mm3的蜂王，4～8 h后转移过程基本结束，但授精8 mm3的蜂王，至少要延长到40 h。有无工蜂，在授精1 mm3或2 mm3时，对贮精囊内最后精于数只有小的或没有影响。而授精4 mm3或8 mm3时，和工蜂关在一起的蜂王贮精囊内的精子数明显多于不带工蜂的蜂王。因此，在采用大精液量授精时，工蜂和蜂王关在一起是很重要的。

1992年拜斯.B报道了“温度对人工授精蜂王的影响”。该文介绍了海角蜜蜂蜂王自然交尾后，贮精囊内有精于659万。而人工授精8 mm3精液，贮精囊内才有精子503万。人工授精量每次以4mm3较好，用8mm3时则精液量过大，反而妨碍了精子进入贮精囊内。实验证明，人工授精前后，蜂王放入王笼内，用200只工蜂陪侍，温度保持在34℃，相对湿度40％最为适宜。相对湿度越高，进入贮精囊内的精子数越少。

1.2 国内蜜蜂人工授精技术的研究

我国早期见于报刊介绍蜂王人工授精技术的是舒少质先生，他在1929年《华北养蜂》月刊第1卷第6期刊发了“蜂王人工授精法之现实”。周庆章先生在1932年《养蜂月刊》第3卷第2期、第4期、第7期，1933年第4卷第3～5期刊发了“蜂王人工交配之研究”。邹雪蓉、李怕琳、郑国安在1963年《中国养蜂》第2期刊发了“蜂王人工授精技术”。

20世纪50年代末，我国蜜蜂人工授精技术进人应用研究阶段。1959年现代养蜂家、北京市农林科学院周崧研究员进行了人工授精技术研究，他在玻璃授精针头、授精仪的改进以及仿雄蜂生殖器授精针头等方面进行了研究和探讨，1964年蜂王人工授精技术在育种工作中得到实际应用。