作为我国宝贵的地方蜜蜂品种资源，中华蜜蜂（Apis ceranacerana）具有独特的生物学特性和生产性能，并具有极大的保护和开发利用价值。中华蜜蜂线粒体DNA方面的研究主要集中在非编码区和COII基因部分的多态性方面。西方蜜蜂（Apis mellifera）核基因组和线粒体基因组均已经测序完毕和公布，而东方蜜蜂（Apis cerana）的核基因组和线粒体基因组序列仍然是空白。从现有数据资料可以看出，蜜蜂线粒体基因组中，AT含量非常高，因此，特异引物的设计和使用具有很大的局限性，引物极容易出现错配，从而出现形成发夹结构和二聚体等不利现象，扩增时会出现大量的非特异性片段和引物损耗，不利于目的片段的扩增和回收纯化等操作。目前，对于东方蜜蜂 tRNAleu～COII基因区间部分序列的扩增多是采用Garnery1992年设计的用于扩增西方蜜蜂tRNAleu～COII基因的E2和H2引物对，用这个引物对可以获得目的片段，除此以外，还没有其他更好的用于扩增蜜蜂非编码区序列的报道，并且长白山区中华蜜蜂分子生物学方面的研究更是较少，为了揭示长白山区中华蜜蜂DNA的分子特性，更好地保护和开发利用我国特有的中华蜜蜂资源，我们开展了本项研究，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1 材料

中华蜜蜂样本采用随机取样法取自长白山区的江源市（42°03′N，126°35′E），代号JY31选定5群蜂，每群取5只工蜂，蜂样浸渍乙醇中保存备用。

1.2 主要仪器

试验仪器主要有DK－8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司），JD300－3－G型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），SZ－93型自动双蒸馏水器（上海亚荣生化仪器厂）， 5417R型高速低温离心机（德国Eppendorf公司），TGL－16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂），Bio型摇匀仪（意大利Micro公司），PCR system2700型PCR仪（美国ABI公司），DYY－2C型电泳仪（北京市六一仪器厂），以及凝胶紫外分析系统、超低温冰箱、普通冰箱、微波炉、移液器等。

1.3 试剂和缓冲液

试剂主要有SDS、蛋白酶K、STE、Rnase·A 酶、饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、T10E1、Taq DNA聚合酶、dNTPs，缓冲液方面包括10×PCR缓冲液、引物、25mmol·L －1MgCl2、6×Loading buffer、1×TAE电泳缓冲液、琼脂糖、EB、100bp DNA Ladder Plus等。

1.4 方法

采用常规方法提取蜜蜂的全基因组。根据已经公开的西方蜜蜂的线粒体基因组的序列设计引物，并由上海生物工程有限公司合成，PCR体系及反应条件参见Garnery等的方法，略加修改。扩增的目的片段送上海生物工程有限公司重复测序。采用DNAMANv5．2．2软件对测得的序列进行分析，并将测序结果与GenBank上面公布的相关序列进行比对，查找单核苷酸多态性突变位点（SNPs），分析长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的序列特性及酶切特点。

2 结果与分析

2.1 长白山区中华蜜蜂全基因组的提取长白山中华蜜蜂全基因组提取后，经过0．8％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。试验提取的长白山中华蜜蜂基因组DNA经紫外分光光度计测定，OD260／OD 280值界于1．8～2．0，表明其纯度较高；从电泳结果看，DNA条带清晰，无拖尾降解现象，可用于特定核酸序列的扩增和测序等试验。

2.2 长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的扩增根据意大利蜜蜂线粒体DNA全序列的特点，自行设计Ncode001a/s、Ncode002a/s、Ncode003a/s、Ncode004a/s、Ncode005a/s、Ncode006a/s、Ncode007a/s、Ncode008a/s、Ncode009/s、Ncode0010a/s等10对引物，并对E2／H2引物对进行修改完善，设计出E2’／H2’引物对。将这12对引物用于长白山中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段序列的扩增，在相同PCR条件下，扩增的产物经0．8％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。电泳结果表明，引物Ncode001a/s、Ncode002a/s、Ncode003a／s、Ncode004a/s、Ncode005a/s、Ncode007a/s、Ncode008a/s、Ncode009/s、Ncode0010a/s扩增的目的条带结果不理想，而Ncode006a／s、E2／H2和E2’／H2’引物对具有较好的扩增结果，并且E2’／H2’引物对比Ncode006a／s和E2／H2引物对具有更强的扩增特异性和扩增效率，是理想的目的片段扩增引物对，其引物序列为E’：5’-GGCAGAATAAGTGCATTGA-ACT-3’，H’：5’-CAATATCATTGATGACCAATTGATT-3’。

2.3 长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的序列及其分析

2.3.1 序列及其比对采用E2’／H2’引物对，对长白山区中华蜜蜂JY31样本mtDNA非编码区至COII基因段进行扩增，将目的片段回收后送上海生物工程有限公司测序。

经过重复测序，有效序列如下：5’-CTTTTATTAAAATTTAATAAGCTACAATTGCATTGAATTCTGAATTCAAACTTAAAGTAAAAAACTTTTATTAAAATTAATAATTTAAATTTATTATTAAAATTTCTACATGATTCATATTTATGTTTCAAGAATCAAACTCATATTATGCTGATAATTTAATCTCATTTCATAATATAGTAATAATAATTATTATTATAATTTCTACTTTAACAGTATATATTATTATAGATCTTTTTTTAAATAAATTTTCAAATCTATTTTTACTAAAAAATCACAATATTGAAATTATTTGAACAGTAATCCCAATTATTATTTATTAATTATTTGTTTTCCATCATTAAAAATTTTATATTTAATTGATGAAATTATAAATCCATTTTTTTCTGTAAAATCAATTGGTCATCAATGATATTG-3’。测得目的片段有效序列大小为 418bp ， 序列中各个碱基组成分别为A165个、T188个、G24个和C41个，A+T含量极高，占84．45％，而G+C的含量只有15．55％。该序列与意大利蜜蜂在核苷酸水平上的种间序列相似性为81．71％。经查找，在GenBank上面登录的已知相关序列并与之比对，结果发现，位于JY31样本mtDNA非编码区至COII基因段第53位置上的碱基发生了转换型突变，由碱基C转换为T，出现一个SNP位点，但是，由于这一突变发生在非编码区，因此，未直接造成氨基酸的变异。

2.3.2 序列的限制性内切酶分析限制性核酸内切酶能够特异识别专一的DNA序列， 并在切割位点将其准确切割。对长白山区中华蜜蜂JY31样本mtDNA非编码区至COII基因段序列进行了180种内切酶的位点分析，结果在该序列上找到了16种酶的34个酶切位点，这16种内切酶分别为AhaIII、AluI、BglII、DpnI、DraI、EcoRI、HinfI、MboI、MfeI、MseI、NlaIII、Sau3AI、SspI、SwaI、VspI、XhoII，结果见表1。从表1可见，限制性核酸内切酶MseI识别T／TAA4个碱基的位点，具有最多13个位点的识别结果，其余的15种核酸内切酶识别的酶切位点数量少，为1个或2个位点。应用这16种核酸内切酶对JY31mtDNA非编码区至COII基因段进行酶切分析，酶切结果见图3。由图3可以看出，16种内切酶都获得了较好的酶切电泳效果，但是，由于MseI酶切位点过多，13个酶切位点应该切出来14条片段，而酶切模式图上面只反映出来12个条带，其中有2个条带和与之大小相近的条带融合在一处。

3 小结与讨论

中华蜜蜂线粒体DNA序列中A和T的含量高，使引物的设计与使用受到局限。E2’／H2’引物对是较好地用于长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段扩增的引物对。长白山区中华蜜蜂的该段DNA序列大小为418bp，序列中A+T含量占84．45％，而G+C的含量只有15．55％。

长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的序列上具有丰富的酶切位点。其中，在JY31样本的序列52位上具有一个特异的MseI的酶切位点，中华蜜蜂在该位点处具有MseI的酶切多态性；AhaIII、DraI、EcoRI、HinfI、MfeI和VspI酶各具有2个酶切位点；AluI、BglII、DpnI、MboI、NlaIII、Sau3AI、SspI、SwaI和XhoII酶分别只具有1个酶切位点。可以将这些限制性核酸内切酶用于中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段DNA序列的长度多态性研究。

经查对分析，本次研究所用样本JY31和已经公布序列的安图、桦甸样本这3个样本的mtDNA的非编码区至COII基因段序列在3个位点处共发生5次突变，说明这3个位点是中华蜜蜂进化过程中比较活跃的位点，其中C→T突变1次，T→C突变2次，G→A突变2次，这些突变都属于转换型点突变，未发现碱基的增加和缺失以及颠换型的突变。

本研究为长白山中华蜜蜂种型的分化和鉴别及其特殊的种性特征提供了一定的依据。揭示了长白山区中华蜜蜂DNA的部分分子特性，这对更好地保护和开发利用我国特有的中华蜜蜂资源提供了在分子水平上的试验支撑。

参考文献（略）

文原载《湖北农业科学》2009.5

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