1 蜜蜂人工授精技术的发展历程

1.1 国外对蜜蜂人工授精技术的研究

文献记载,人类在200多年以前开始探索蜜蜂人工授精技术。18世纪到19世纪初,人们探索蜜蜂人工授精的方式方法比较杂乱,有人把雄蜂精液滴在蜂王的蛹或成虫上,也有人把雄蜂精液涂到未受精卵上, 或者在蜂王体表的不同部位进行授精,但都没有成功。1814年瑞士科学家 F. 于北,最早进行蜜蜂人工授精试验,他用一种毛笔状的工具,把雄蜂精液涂抹在蜂王阴道口上,虽然这个尝试未能成功,但他的试验给后来人以有益的启示。1883年德国 W. 汪克勒设计了一个能插入蜂王阴道的注射针头,称其为 “人工阴茎”, 使用时装在一只注射器上。1887 年美国 N.W. 麦克莱恩用木板制造了一个蜂王夹板,把蜂王固定在夹板的凹槽里, 夹板外露出蜂王腹部末端几节, 用一支皮下注射器和一枚加工过的针头采集雄蜂精液并进行人工授精。 19 世纪末还有人采用玻璃细管进行采精, 精液用生理盐水稀释后给蜂王授精。同一时期, 多个国家先后出现了用手或简单装置把蜂王固定住, 一手拿着雄蜂, 试图在人手的撮合下, 使雄蜂和蜂王进行交配;后来, 还有人把雄蜂精液滴入到性成熟蜂王打开着阴门里。进行这种“手持交配”经历了一个很长的时期, 从19世纪末到20世纪50年代很多人都进行了这种试验。但是前苏联 V.V. 特里亚斯特经过多次认真试验后得出的结论是: 无论采用哪种“手持交配”的方法,精子进入蜂王受精囊的数量都很少, 其精子数量只有自然交尾的 0.5%~2.0% , 没有实用价值。此后, 还有人把大量的雄蜂和蜂王囚禁在笼内进行交配尝试, 都没有成功。1924 年美国 R.L.沃森开始研究蜂王人工授精技术。他熟悉吹玻璃管技术,因而设计制造了微量注射器。1927 年沃森设计成功了微量注射器和授精装置, 把微量注射器安装在具有两向导轨的巴伯吸量管操纵系统上, 再组装在体视显微镜台上,控制注射器的移动, 蜂王固定夹板用橡皮筋固定在镜台的另一端,用解剖镊子张开蜂王的背腹板进行人工授精, 结果取得了前所未有的成绩。因此, 世界公认沃森为现代蜜蜂人工授精技术的创始人, 这种技术又称之为蜂王器械授精。

1928 年美国 W.J. 诺兰掌握了沃森的蜂王授精器械操作技术后, 设计制造了拉开蜂王螫针腔的弹夹、背钩和腹钩, 用玻璃管制作成了蜂王固定器。1930年美国 H.H. 莱德劳将二氧化碳通入蜂王固定器的管内作为麻醉剂, 使蜂王麻醉,便于人工授精操作。1931 年莱德劳制造出了一个马蹄形的弹夹, 用以打开蜂王螫针腔。1933 年莱德劳解剖了一些自然交尾后返回蜂巢的蜂王, 他发现在蜂王阴道中部有一个舌状阴道瓣突的作用如同一个阀门, 在它突起时完全关闭中输卵管的开口, 对蜂王交配后防止精液外流和促使精子转移到受精囊中有重要作用, 同时得出结论,人工授精针头必须越过阴道瓣突把精液注入到输卵管内。他用一个细金属环使阴道瓣突倒下, 以露出中输卵管口。1944年莱德劳根据蜂王阴道内的特殊结构,制造了用于压低阴道瓣突的阴道探针,人工授精时让针头沿着阴道探针的背面顺利进入到蜂王中输卵管内。

20 世纪 30 年代以后美国 H.H. 莱德劳、 O.W. 麦肯森、 W.J. 诺兰、 W.C. 罗伯茨、 J.R. 哈博、德国F. 鲁特纳以及前苏联 T.A. 阿维季相等人对蜜蜂人工授精注射器、针头、蜂王麻醉器以及注射操纵装置等部件不断进行改进。

1944 年美国 W.C. 罗伯茨等人发现蜂王有重复交配现象, 蜂王须与 6~9 只雄蜂交配,认为对每只蜂王进行人工授精也须应用多只雄蜂的精液,才能达到与自然交尾相同的效果。 1947 年 O.W. 麦肯森发现,用二氧化碳作麻醉剂不仅对蜂王无害, 而且还有消除发情反应和刺激蜂王提早产卵的作用。麦肯森还研究了隔膜式注射器, 使人工授精的工作效率和成功率有了很大提高。

20 世纪在世界上通用的麦肯森注射器就是以他的姓名命名的。麦肯森注射器研究成功后第 3年,H.H. 莱德劳设计了带有螺旋推进导轨并与麦肯森注射器配套的人工授精仪, 莱德劳还首先使用了抗生素的稀释液, 降低了细菌对精液的污染,提高了人工授精蜂王的成功率。20 世纪 80 年代,德国 F. 鲁特纳等人又设计了一种结构精密、性能优良的多向导轨的人工授精仪。至此, 蜜蜂人工授精技术、仪器设备以及理论研究, 均达到相当高的水平。

2003 年周玮译 “小型万维手动 schleyⅡ 型人工授精仪的改进”。该文介绍了 schley 公司长期致力于人工授精仪技术的教学实践, 面对众多不同需求的学生工作, 促使 schley 公司设备不断改进创新,每次技术改进都使设备更加实用。对于严谨的蜜蜂育种工作者而言, 蜜蜂人工授精技术是一项十分重要的技术,新型的 schleyⅡ 型人工授精仪它使得蜜蜂人工授精技术更加容易掌握。

1.1.1         雄蜂精液采集与常温贮存及授精技术的研究进展

1969 年美国 Poole 和 Taber 在试管内贮藏雄蜂精液已经获得成功,在室温下能够将精液贮藏13个星期,1970年他们用麦肯森注射器采集精液, 然后经过离心,火焰封口,在 10~13℃下贮藏35个星期。并用麦肯森注射器采集精液, 然后经过离心、火焰封口,进行贮藏。这种方法把精液从注射器转注到毛细管不仅要花费时间, 而且使精液容易受到污染。1974年 Harbo 设计了一种能在可装卸的毛细管内注射器和贮存精液的注射器,毛细管的容量为 50~60μL ,一端拉成针头。使用这种注射器就不需要将精液转注到贮藏管内,也不需要离心了,直接可进行人工授精。但是,它不能精确控制精液的移动,玻璃拉制的针头和推杆容易破损。19 80年 Kaftanoglu&Peng 把麦肯森注射器的针头加以改造, 研究成功了一种新型注射器。这种新型注射器既可用来贮藏精液,又可进行人工授精。该注射器有良好的吸力, 又有平衡压力的泄压孔, 在拆装时不觉动毛细管内的精液柱,还有一个精确的控制机构。每个贮藏管盛装的精液可以给多只蜂王授精。同时他们还研究了采集雄蜂精液的漂洗技术。其精液采集器由漂洗精液的漏斗、聚乙烯连接管和精液采集管三部分组成。此漂洗方法操作容易而快速,无需借助于显微镜, 在短时间内能够容易地采集到大量的雄蜂精液, 它比传统的采集精液的方法更快速。

1.1.2         影响进入人工授精蜂王贮精囊内精子数量的研究

1944 年以前人们认为蜂王只与一只雄蜂交配,因此早期蜜蜂人工授精仅以 1.0~2.5 mm 3 (μL)精液来授精, 其进入蜂王贮精囊内精子数量平均没有显著差别。1951年Tryasko ,1954 年 Taber , 1955年Woyke 发现蜂王在一次婚飞中可进行多次交配。1960年波兰 J.Woyke 发现一次成功的自然交尾后的蜂王在它们贮精囊内大约有 5.34 百万个精子。一个雄蜂可射出 11 百万个精子, 几乎是蜂王贮精囊装载的 2 倍。然而用 1 mm 3 精液约 7.0 百万个精子给蜂王人工授精时,仅有1.39百万个精子 (20%) 进入蜂王贮精囊, 若使用8mm3 精液 (约56百万个精子)给蜂王进行人工授精,进入蜂王贮精囊内的精子只有授精量的 9.6%;1964 年美国 Mackense 的试验为 5.2% 。因此, Woyke建议凡仅一次人工授精的蜂王可用 8 mm3精液, 分作两次人工授精时, 每次可用 4mm3精液,并认为进入蜂王贮精囊内的精子数多少取决于注射精液数量(Mackense , 1964) 。 1960 年 Woyke , 1975 年 Foti 发现自然交尾的蜂王, 贮精囊较大的比贮精囊较小的含有更多的精子数。

1970 年 Vesely 授精后的蜂王放在核群内自由活动,则它的输卵管内的精液会排除干净, 可增加进入贮精囊的精子数。反之, 蜂王被保存在纱笼内, 则精液会滞留在输卵管内。1967 年、1971年 Woyke 移植最小的幼虫培育出的蜂王, 可增加贮精囊进入的精子数。1973 年 Woyke&Jasinski授精后把蜂王保存在温度为34℃处,比把蜂王放回温度较低的哺育笼内进入贮精囊内的精子数量多。1974 年 Woyke , Jasinski和 Smagowska 发现, 用相等数量的精液不同种系的蜂王进行人工授精, 其贮精囊内的精子数目在统计学上意大利蜂×高加索蜂的杂交王显著高于高加索蜂×卡尼鄂拉蜂的杂交蜂王。1975年 Foti,Grosu和Dragan报道, 蜂王在授精前后与30只工蜂一起关在笼内,其结果与蜂王保持在核群内一样。1976年 Woyke 和Jasinski当蜂王达到 5~14日龄时可进行人工授精。

1979 年 Woyke 报道了工蜂与蜂王的接近对人工授精结果的影响, 总共96只蜂王,各以 8 mm3精液进行人工授精, 授精后的蜂王被分放到: 1 )在不伴有工蜂的哺育纱笼内; 2 ) 带有 10 个工蜂的哺育纱笼内;3 ) 具有隔王片的哺育笼内; 4 ) 在两面具有隔王片的 10×6.5×2.5 cm的雄蜂蜂笼内; 5 ) 在两面具有隔王板片带有巢脾的 16×6.5×2.5 cm 的小隔离器内;6 ) 在能够遮盖整个巢脾 26×36 cm 具有隔王板片的大型隔离器内。授精后 48 h 解剖蜂王, 检查输卵管内精子的存在, 并计算贮精囊内的精子数,其结果是:在纱笼里无论有无工蜂伴随蜂王, 有5.6% 的蜂王输卵管内有残留的精液; 而保存在隔王笼或隔王器内的蜂王, 有4.7%的蜂王输卵管内有残留的精液。在没有工蜂伴随的纱笼内的蜂王, 其贮精囊内只3.02百万个精子; 在配备有隔王片的隔离器内的蜂王,其贮精囊的精子增加75%。因此, 建议授精后的蜂王应放在有隔王片制造的隔王器内的巢脾上, 直到它开始产卵。

蜜蜂人工授精仪

1982 年 Woyke 等人报道了伴随工蜂数量对保存的室外小交尾群的人工授精蜂王贮精囊内精子数的影响,将160只蜂王全部用 8 mm3精液授精, 分别放入1 脾和 4 脾两种类型的交尾箱内, 每10群为一组, 8组每小群的工蜂数分别为: 0只, 50只, 100只,200只,350只,500只,750只,1000只。小群放在室外, 每天分别在 8 : 30 , 13 : 00 和 20 : 00用热电偶测定箱内外温度。授精2天后, 20只蜂王中除了5只没有工蜂伴随的死亡外, 其余蜂王的输卵管中仍留有残余的精液。几乎所有由 100 只或更多伴随工蜂的蜂王的输卵管内有残余的精液。1脾或4脾没伴有工蜂的小群中的蜂王贮精囊内精子量最少为1.4 百万和1.2 百万。50只有工蜂伴随的蜂王贮精囊内精子数量有两倍增加, 达到 2.6百万和 2.7百万。工蜂数量增加到 200 只时, 贮精囊内精子数量仅稍有增加, 但当伴随蜂数增加到 350 只时, 贮精囊内精子数达到 3.7百万和 3.6 百万。为没有工蜂伴随的蜂王精子数的3倍,为有 50 只伴随工蜂的蜂王精子数的 1.4倍,进一步增加工蜂数直到 1 000只,贮精囊内精子只有很少或没有增加, 平均为 3.95 百万和 3.68 百万,差异不显著。伴随工蜂数量的增加, 使蜂群温度从 18.0 ℃升至 31.6 ℃ 。为使蜂王贮精囊得到正常数量的精子, 室外小核群中的人工授精蜂王至少要有 350 只伴随工蜂。

1982年美国A.B.伯尔坦等报道了少量多次授精与蜂王贮精囊中的精子量,用少量的稀释精液给蜂王多次授精,进入贮精囊中的精子数量显著多于等剂量的一次性授精(P< 0.01)。数次相同的小剂量授精,第二次授精进入贮精囊中的精子数量高于第一次, 使用液态氮(- 196℃)贮存的精液,在不同的两组试验中,第二次授精进入贮精囊的精子数分别占总数的 77%和 68% , 用新鲜的稀释精液时第二次占61% 。

1983 年Woyke 报道精子进入人工授精蜂王贮精囊的动态, 授精1 mm 3 ,2mm 3 ,4 mm 3 或8 mm3的蜂王,每只蜂王带伴随工蜂 250只,放在 34℃ 温箱内或不带工蜂关在无王群内, 最初4 h授精量与有无工蜂对精子进入贮精囊的速度影响极小,为20~30万/h。授精1 mm3 和2 mm3的蜂王, 4~8 h 后转移过程基本结束, 但授精8 mm3的蜂王,至少要延长到40 h。有无工蜂,在授精1 mm 3或2 mm 3时,对贮精囊内最后精子数只有小的或没有影响。而授精4 mm3 或8mm3时,和工蜂关在一起的蜂王贮精囊内的精子数明显多于不带工蜂的蜂王。因此, 在采用大精液量授精时, 工蜂和蜂王关在一起是很重要的。

1992 年拜斯.B 报道了“温度对人工授精蜂王的影响”。该文介绍了海角蜜蜂蜂王自然交尾后, 贮精囊内有精子 659 万。而人工授精8 mm3精液,贮精囊内才有精子503万。人工授精量每次以4 mm3较好,用8 mm3时则精液量过大,反而妨碍了精子进入贮精囊内。实验证明,人工授精前后,蜂王放入王笼内,用200只工蜂陪侍, 温度保持在34℃, 相对湿度40% 最为适宜。相对湿度越高, 进入贮精囊内的精子数越少。

( 未完待续)

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文/泽华

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责任编辑：小蜜  吴迪