羟甲基糠醛通常由果糖脱水生成，葡萄糖受酸和热的影响也能产生此物质。新鲜优质的蜂蜜中不含羟甲基糠醛，它是在加工、贮存过程中或人为掺入的转化糖产生的。
蜂蜜中羟甲基糠醛( HMF)含量的测定
【名称】蜂蜜中羟甲基糠醛( HMF)含量的测定
羟甲基糠醛通常由果糖脱水生成，葡萄糖受酸和热的影响也能产生此物质。新鲜优质的蜂蜜中不含羟甲基糠醛，它是在加工、贮存过程中或人为掺入的转化糖产生的。
羟甲基糠醛是衡量蜂蜜质量的重要指标，一般不应超过40×10-6。检测它的方法主要有定性分析和定量分析两种。
(1)费氏反应：
①原理：利用乙醚萃取蜂蜜样品，然后与间苯二酚盐酸溶液反应，如反应后有樱桃红色出现，则证明有羟甲基糠醛存在，费氏反应为正，否则为负。
②试剂：1%间苯二酚盐酸溶液：将0. lg间苯二酚放入烧杯中，加入10ml浓盐酸（相对密度1.19）。间苯二酚盐酸溶液应为无色液体，在测定前配制。
乙醚（分析纯）：滴入间苯二酚盐酸溶液后应为无色，挥发后应无残留物。必要时，用氯化钙干燥、蒸馏，加入金属钠备用。处理乙醚时不能使蒸馏瓶蒸干；加入金属钠的乙醚必须为无水乙醚，否则有爆炸的危险。
③检测方法（研磨法）：置5.0g蜜样于研钵中，加3ml乙醚后，用钵槌研磨至乙醚完全挥发（约1.5min），然后每次加入3ml乙醚研磨1min（约60次），使剩余乙醚约lml，倾入洁净的瓷蒸发皿中，如此反复3次，将所有收集到的乙醚萃取物在室温下任其挥发，如有水滴残留，可加微热（不超过40℃）后再使其挥发冷却。滴加3-4滴间苯二酚盐酸溶液，立即旋摇，使残留物全部润湿，静置lh后观察，如有樱桃红色出现，即为正反应，反之为负。
(2)定量测定：定量测定羟甲基糠醛的方法主要有分光光度计法和紫外分光光度计法。
①分光光度计法：羟甲基糠醛遇对甲基苯胺和巴比妥酸能产生红色，颜色的深浅与羟甲基糠醛的含量呈正相关。用分光光度计在550nm波长处测定其光密度值，即可计算出羟甲基糠醛含量。
采用此方法测定时应注意，对甲苯胺为有毒物质，操作中应小心；羟甲基糠醛与对甲苯胺和巴比妥酸产生的红色化合物很不稳定，因此，最好将试管浸在5 --10℃冷水浴中显色。测定时动作要快，并避免一系列样液都显色好后进行测定，以防止误差过大。
I．试剂和仪器：
i．巴比妥酸溶液：将500mg巴比妥酸（分析纯）溶解于70ml蒸馏水中，置水浴上加热搅拌使其溶解。冷却，移人100ml容量瓶中，用蒸馏水定容。
ii．对甲苯胺溶液：称取10. 0g对甲苯胺（分析纯），溶解于50ml的异丙醇（分析纯）中，温热溶解后用异丙醇转移至100ml的容量瓶中，加入10ml冰醋酸，冷却后再用异丙醇定容，置暗处24h后备用。
iii.无氧蒸馏水：经煮沸后冷却的蒸馏水。
iv.分光光度计。
Ⅱ．测定方法：称取蜂蜜样品10g，溶于20ml无氧蒸馏水，转移至50ml容量瓶中，再用无氧蒸馏水定容，并混合均匀。分别吸取样液2.0ml于2个试管中，在每个试管中加入5. 0ml对甲苯胺溶液，之后，在一个试管中加入lml无氧蒸馏水（作参比液），另一试管中加入lml巴比妥酸溶液，两试管立即振荡混匀。用1cm比色池，以参比液作对照，于分光光度计550nm波长处测定样液的光密度，读取最大光密度值。
Ⅲ．计算：按式(9 -11)计算。
羟甲基糠醛(mg/100g)=光密度值×19.2
(1) 式中：
19.2--测定HMF值的经验换算系数。
②紫外分光光度计法：在蜂蜜溶液中加入亚硫酸氢钠，使蜂蜜中羟甲基糠醛与亚硫酸氢钠发生加成反应。加成产物破坏了羟甲基糠醛的284生色团。用此液作参比液，蜂蜜的透明液为样液，在波长为284nm条件下测定其吸光值，可抵消蜜样中其他杂质的干扰，提高测定的灵敏度。
I．试剂与仪器：澄清剂A｛溶解15g亚铁氰化钾[K4Fe (CN)6.3H20，分析纯]于蒸馏水中，并定容至100ml}，澄清剂B{溶解30g乙酸锌[Zn (CH3C00)．2H20，分析纯]于蒸馏水中，并定容至100ml}。0.20%亚硫酸氢钠溶液[溶解0.20g亚硫酸氢钠（分析纯）于蒸馏水中，并定容至100ml，临用时配制]。另外，还有紫外分光光度计。
Ⅱ．测定方法：用蒸馏水将5g（精确至0.001g）蜂蜜样品转移至50ml容量瓶中，加入0.5ml澄清剂A混合，再加入0.5ml澄清剂B混合，用水稀释至刻度（必要时可加入1滴乙醇以消除表面的泡沫）。混匀后过滤，弃除最初的10ml滤液。
吸取滤液各5ml于2个试管中，在一个试管中加入5ml 0.20%亚硫酸氢钠溶液，混匀，作参比液；在另一试管中加入5ml蒸馏水，混匀，作待测液。然后用参比液为对照，在紫外分光光度计波长284nm和336nm处，测定待测液的吸光度（如果吸光度大于0.6，则用蒸馏水稀释待测液，用0.20%亚硫酸氢钠溶液同样稀释参比液，在计算时将吸光度乘以稀释倍数）。
式(2)
羟甲基糠醛通常由果糖脱水生成，葡萄糖受酸和热的影响也能产生此物质。新鲜优质的蜂蜜中不含羟甲基糠醛，它是在加工、贮存过程中或人为掺入的转化糖产生的。
羟甲基糠醛是衡量蜂蜜质量的重要指标，一般不应超过40×10-6。检测它的方法主要有定性分析和定量分析两种。
(1)费氏反应：
①原理：利用乙醚萃取蜂蜜样品，然后与间苯二酚盐酸溶液反应，如反应后有樱桃红色出现，则证明有羟甲基糠醛存在，费氏反应为正，否则为负。
②试剂：1%间苯二酚盐酸溶液：将0. lg间苯二酚放入烧杯中，加入10ml浓盐酸（相对密度1.19）。间苯二酚盐酸溶液应为无色液体，在测定前配制。
乙醚（分析纯）：滴入间苯二酚盐酸溶液后应为无色，挥发后应无残留物。必要时，用氯化钙干燥、蒸馏，加入金属钠备用。处理乙醚时不能使蒸馏瓶蒸干；加入金属钠的乙醚必须为无水乙醚，否则有爆炸的危险。
③检测方法（研磨法）：置5.0g蜜样于研钵中，加3ml乙醚后，用钵槌研磨至乙醚完全挥发（约1.5min），然后每次加入3ml乙醚研磨1min（约60次），使剩余乙醚约lml，倾入洁净的瓷蒸发皿中，如此反复3次，将所有收集到的乙醚萃取物在室温下任其挥发，如有水滴残留，可加微热（不超过40℃）后再使其挥发冷却。滴加3-4滴间苯二酚盐酸溶液，立即旋摇，使残留物全部润湿，静置lh后观察，如有樱桃红色出现，即为正反应，反之为负。
(2)定量测定：定量测定羟甲基糠醛的方法主要有分光光度计法和紫外分光光度计法。
①分光光度计法：羟甲基糠醛遇对甲基苯胺和巴比妥酸能产生红色，颜色的深浅与羟甲基糠醛的含量呈正相关。用分光光度计在550nm波长处测定其光密度值，即可计算出羟甲基糠醛含量。
采用此方法测定时应注意，对甲苯胺为有毒物质，操作中应小心；羟甲基糠醛与对甲苯胺和巴比妥酸产生的红色化合物很不稳定，因此，最好将试管浸在5 --10℃冷水浴中显色。测定时动作要快，并避免一系列样液都显色好后进行测定，以防止误差过大。
I．试剂和仪器：
i．巴比妥酸溶液：将500mg巴比妥酸（分析纯）溶解于70ml蒸馏水中，置水浴上加热搅拌使其溶解。冷却，移人100ml容量瓶中，用蒸馏水定容。
ii．对甲苯胺溶液：称取10. 0g对甲苯胺（分析纯），溶解于50ml的异丙醇（分析纯）中，温热溶解后用异丙醇转移至100ml的容量瓶中，加入10ml冰醋酸，冷却后再用异丙醇定容，置暗处24h后备用。
iii.无氧蒸馏水：经煮沸后冷却的蒸馏水。
iv.分光光度计。
Ⅱ．测定方法：称取蜂蜜样品10g，溶于20ml无氧蒸馏水，转移至50ml容量瓶中，再用无氧蒸馏水定容，并混合均匀。分别吸取样液2.0ml于2个试管中，在每个试管中加入5. 0ml对甲苯胺溶液，之后，在一个试管中加入lml无氧蒸馏水（作参比液），另一试管中加入lml巴比妥酸溶液，两试管立即振荡混匀。用1cm比色池，以参比液作对照，于分光光度计550nm波长处测定样液的光密度，读取最大光密度值。
Ⅲ．计算：按式(9 -11)计算。
羟甲基糠醛(mg/100g)=光密度值×19.2
(1) 式中：
19.2--测定HMF值的经验换算系数。
②紫外分光光度计法：在蜂蜜溶液中加入亚硫酸氢钠，使蜂蜜中羟甲基糠醛与亚硫酸氢钠发生加成反应。加成产物破坏了羟甲基糠醛的284生色团。用此液作参比液，蜂蜜的透明液为样液，在波长为284nm条件下测定其吸光值，可抵消蜜样中其他杂质的干扰，提高测定的灵敏度。
I．试剂与仪器：澄清剂A｛溶解15g亚铁氰化钾[K4Fe (CN)6.3H20，分析纯]于蒸馏水中，并定容至100ml}，澄清剂B{溶解30g乙酸锌[Zn (CH3C00)．2H20，分析纯]于蒸馏水中，并定容至100ml}。0.20%亚硫酸氢钠溶液[溶解0.20g亚硫酸氢钠（分析纯）于蒸馏水中，并定容至100ml，临用时配制]。另外，还有紫外分光光度计。
Ⅱ．测定方法：用蒸馏水将5g（精确至0.001g）蜂蜜样品转移至50ml容量瓶中，加入0.5ml澄清剂A混合，再加入0.5ml澄清剂B混合，用水稀释至刻度（必要时可加入1滴乙醇以消除表面的泡沫）。混匀后过滤，弃除最初的10ml滤液。
吸取滤液各5ml于2个试管中，在一个试管中加入5ml 0.20%亚硫酸氢钠溶液，混匀，作参比液；在另一试管中加入5ml蒸馏水，混匀，作待测液。然后用参比液为对照，在紫外分光光度计波长284nm和336nm处，测定待测液的吸光度（如果吸光度大于0.6，则用蒸馏水稀释待测液，用0.20%亚硫酸氢钠溶液同样稀释参比液，在计算时将吸光度乘以稀释倍数）。
式(2)