A.1.10 显微镜： 10×～100×。

A.2 培养基和试剂

A.2.1 30％葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）

A.2.1.1 成分

无水葡萄糖        30.0 g

蒸馏水               100 mL

A.2.1.2 制法

称量适量葡萄糖，溶解在蒸馏水中，必要时调节 pH 为 6.4 左右。分装后，115 ℃高压灭菌 20 min。

A.2.2 氯硝胺 18%甘油（ DG18）琼脂

A.2.2.1 成分

酪蛋白胨                                  5.0 g

无水葡萄糖                              10.0 g

磷酸二氢钾                              1.0 g

硫酸镁（MgSO４·H_２O）      0.5 g

氯硝胺                                     0.002 g

无水甘油                                 200 g

琼脂                                        15 g

氯霉素                                     0.1 g

蒸馏水                                    1000 mL

A.2.2.2 制法

除氯霉素外，将全部成分加热煮沸至完全溶解，如有必要，调节 pH 为 6.4 左右。加入抗菌素，121 ℃高压灭菌 15 min，最终的 pH 应为 5.6±0.2。灭菌后，立即在 44 ℃～47 ℃水浴冷却至 50 ℃以下，在每个灭菌平皿中倾注大约 15 mL～20 mL 培养基，放置在水平的台面上冷却固化备用。如有必要，可以放在 36 ℃培养箱中过夜，使琼脂表面干燥无水珠。避光保存。

A.3 检验程序

嗜渗酵母检验程序见图 A.1。

A.4 操作步骤

A.4.1 样品采集和保存

样品采集后，应尽可能及时检验。若不能及时检验，普通样品应置 2 ℃～5 ℃冰箱保存，在 24 h 内检验。冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min 或在 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。

A.4.2 样品稀释

A.4.2.1 取样

以无菌操作在天平上称取固体或液体检样 25 g，加入 30％葡萄糖稀释液 225 g，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 均质 1 min，或拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入加有玻璃珠的无菌锥形瓶中，并充分振荡。

A.4.2.2 梯度稀释

用灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 30％葡萄糖稀释液的试管内，置于漩涡混悬仪上混匀，制备 1:100 的稀释液。 另取 1 mL 灭菌吸管，按前操作依次制备 10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 灭菌吸管。

A.4.3 涂布和培养

A.4.3.1 根据对检样污染情况的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种 2个 DG18 琼脂平板。在充分混合稀释液之后，立即在每个平板表面接种 0.1 mL，接着用无菌的 L 型涂布棒进行充分的琼脂表面涂布。注意涂布棒下端不得触碰培养皿的侧缘。进行样品检验的同时，应同时在 2 个 DG18 琼脂平板表面接种 0.1 mL 的稀释液作为空白对照。

A.4.3.2 接种完成后，尽快将全部平板置 25 ℃±1 ℃恒温箱内避光培养。培养时勿翻转培养皿。为防止出现霉菌的过度蔓延生长掩盖了目标菌落，在培养 48 h 后，即开始每日观察平板上面真菌生长情况。培养 7 d 结束。

A.4.4 菌落计数

A.4.4.1 选择菌落数量在 15～150 之间的平板，计数菌落数量。

A.4.4.2 典型的嗜渗酵母在 DG18 琼脂平板上呈现为圆形、中心隆起、不透明、边缘整齐的菌落，直径 1 mm～2 mm。必要时，可利用低倍显微镜直接观察平板上生长的菌落是否为细菌菌落。如出现霉菌菌落干扰时，不应计数丝状菌落。

A.4.5 报告

参照 GB 4789.2 的报告方式，以 CFU／g 为单位报告样品中嗜渗酵母的数量。