1、实验部分
1.1仪器与试剂
高效液相色谱仪(Agilent 1200,美国Agilent公司),三重四极杆串联质谱联用仪(API4000,美国AB公司);高纯水发生器(ELGA-Q15,英国ELGA公司);涡旋混合器;固相萃取装置;氮吹浓缩装置。
双稠吡咯啶类生物碱标准品:野百合碱(mono-rotaline)、克氏千里光宁(senkirkine)、倒千里光碱(retrorsine)、千里光菲啉(seneciphyline)、千里光宁(senecionine),纯度均为99%,德国Dr.Ehren-torfer公司。乙腈、甲酸、醋酸铵为色谱纯,购自德国Merck公司;甲醇、氨水和盐酸为分析纯;试验用水均为去离子水。强阳离子固相萃取柱(OasisMCX,3mL/60mg,美国Waters公司)。国产蜂蜜样品来自中国8个省及自治区,进口蜂蜜来自新西兰、西班牙和澳大利亚。
1.2标准溶液的配制
分别称取5种双稠吡咯啶类生物碱标准品各0mg于10mL容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1/L的标准储备液,密封保存于4°C冰箱中。再分别准确吸取1g/L的5种单标准储备液各1mL于00mL容量瓶中,用甲醇定容得10mg/L的混合标准溶液。使用时用初始流动相将混合标准溶液稀释成系列浓度的标准溶液,待测。
1.3样品前处理
准确称取2.0g样品于50mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10mL0.1mol/L盐酸,涡旋混合均匀。OasisMCX固相萃取柱预先用3mL甲醇和3mL水活化,将样品溶液以小于1mL/min的流速过柱,依次用3mL水和3mL甲醇淋洗,加入5mL%(如无特殊说明均为体积分数)氨水甲醇溶液洗脱。收集的洗脱液于40°C下用氮气吹干,用2.0mL乙腈-水(25∶75,v/v)溶液溶解,过0.45μm有机和水相滤膜后供HPLC-MS/MS分析测定。
1.4色谱-质谱条件
1.4.1色谱条件
色谱柱为PhenomenexKinetexC18(100mm×4.6mm,2.6μm)。流动相A为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液,流动相B为乙腈。流动相梯度:0~3min,10%B;3~4.5min,10%B~90%B;4.5~10min,90%B;10~11min,90%B~10%B;11~13min,10%B。流速0.50mL/min;进样量5μL;柱温30°C。
1.4.2质谱条件
扫描方式:电喷雾正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压:4500V;去簇电压:80V;气帘气压强:69kPa;碰撞气压强:34.5kPa;去溶剂温度:500°C;雾化气压强:345kPa;辅助气压强:345kPa;5种双稠吡咯啶类生物碱的质谱检测详细参数见表1。