蜂蜜淀粉酶值的测定

【名称】蜂蜜淀粉酶值的测定 
      蜂蜜的淀粉酶值是指以每克蜂蜜中所含的淀粉酶，在40℃的条件下，lh内能转化1%淀粉溶液的毫升数。正常情况下蜂蜜的淀粉酶值都在8以上。蜂蜜淀粉酶值的测定有试管比色法和分光光度法两种。 
      (1)试管比色法： 
      ①原理：淀粉和游离碘在水溶液中能够产生蓝色反应。蜂蜜中的淀粉酶分解淀粉溶液后，向淀粉溶液中滴人碘液，根据加入蜂蜜样液和淀粉溶液的量计算蜂蜜的酶值。 
      ②试剂：配制试剂所用的蒸馏水，应煮沸冷却后备用。 
      0.05mol/L氢氧化钠溶液：溶解2g氢氧化钠于1000ml蒸馏水中。 
      0.1 moL/L氯化钠溶液：溶解0.59g氯化钠（分析纯）于100ml蒸馏水中。 
      0.2mol/L乙酸溶液：吸取0.6ml的20%乙酸溶液于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线。 
      1%淀粉溶液：准确称取1.00g（以干态计）可溶性淀粉（分析纯）于烧杯中，加入少量蒸馏水使成薄浆，加入60ml沸腾蒸馏水，在搅拌下煮沸1- 2min，使其透明。稍冷，用蒸馏水清洗，使淀粉溶液全部移入100ml容量瓶中，冷却后用蒸馏水定容，摇匀备用。淀粉溶液应在测定前配制，其pH值为4.8 -5.5，取0.2ml溶液，用蒸馏水稀释至30ml，加1滴0.1mol/L碘溶液试验时，应显纯蓝色。 
      0.1 mol/L碘溶液：把12.69g升华碘和18.00g碘化钾溶解于1000ml蒸馏水中。 
      酚酞指示剂：溶解酚酞粉末1.0g于100ml的95%乙醇溶液中。 
      ③测定方法：称取蜂蜜样品10,00g，溶解于约60ml蒸馏水中，加入酚酞指示剂2-3滴，用0.05mol/L氢氧化钠溶液中和，再转移至100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容。 
      取标有序号的相同试管12只，按表1序号分别加入蜂蜜样液、蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠溶液、0.2mo]/L乙酸溶液和1%淀粉溶液，摇匀后，立即将所有试管同时浸入45 -50℃水浴中，使试管液面浸入水浴水面下约3cm，在此温度下放置lh。 
            表1    蜂蜜淀粉酶值

 

 

 

      酶值=淀粉溶液毫升数×10/蜂蜜样液毫升数 
      取出试管时应立即在冷水中冷却，并给每个试管中加1滴0.1 mol/L碘溶液，摇匀后立即观察。此时，各试管的颜色顺次由黄色经红色、紫红色、紫色至蓝色，根据紫红色试管号数，由表1查出该蜂蜜样品的淀粉酶值。必要时可多加1滴碘溶液后观察。 
      (2)分光光度计法：即蓝值法，是国际上通用的一种方法。对蜜样的淀粉酶值如有争议，应以本方法测定的为准。 
      ①原理：一定量的蜂蜜样品与醋酸等形成的缓冲溶液，当其pH值为5.3（一般酶的活性pH值为4-7时活力最大）时，加入一定量的标准淀粉溶液，经酶一定时间的水解，再用碘液使剩余的淀粉显蓝色，于660nm波长处测定其吸收值（即蓝值），并记录其吸收值降低至0.235时所耗的时间，从而计算出蜂蜜中的淀粉酶值。 
      ②试剂配制和仪器： 
      碘贮备液：准确称取22.00g碘化钾（分析纯），置于50ml的烧杯中，加入约30ml的蒸馏水混合均匀。在烧杯中再加入8.80g碘（分析纯），搅拌均匀后将烧杯中的溶液移至1000ml的容量瓶中，加蒸馏水定容。 
      0.0007mol/L碘溶液：用蒸馏水溶解20.00g碘化钾（分析纯）于500ml的容量瓶中，加入5ml碘贮备液，然后用蒸馏水定容至刻度，混匀。此液有效期为2d，超过2d应重新配制。 
      乙酸缓冲溶液（pH值5.3，1.5mol/L）：将87.00g三水合乙酸钠（分析纯）置于500ml容量瓶中，加约400ml蒸馏水使其溶解，再加入10.50ml乙酸（分析纯）。混合均匀后，通过加入乙酸钠和醋酸将缓冲液调整至pH值5.3。最后用蒸馏水定容至500ml。 
      0.5moL/L氯化钠溶液：称取14.50g氯化钠溶于煮沸过的蒸馏水中，并定容至500ml。此液保存时间以长出霉菌为限。 
      可溶性淀粉：使用前应测定其蓝值。准确称取可溶性淀粉（分析纯）1. 00g（以干态计），放入250ml的三角烧瓶中，加入80ml蒸馏水，边搅拌边迅速加热至沸腾。然后以小火保持微沸3 min，加盖并冷却至室温。100ml的容量瓶中加入2.5ml乙酸缓冲溶液，再将煮沸冷却后的淀粉液移入此三角瓶中。三角瓶放入40C水浴中恒温，并用蒸馏水定容。此淀粉溶液置于40℃恒温水浴中供测定样品用。 
      酚酞指示剂：溶解酚酞粉末1.0g于100ml的95%乙醇溶液中。 
      恒温水浴锅40cC±0.2℃，分光光度计（在660nm处进行测定）；酸度计及50ml具塞试管等。 
      ③测定方法： 
      I．样液的制备：称取蜂蜜10. 00g于50ml烧杯中，加5.0ml乙酸缓冲液和20ml蒸馏水，搅拌混合，使样品完全溶解。然后移入已加有3.0ml氯化钠溶液的50ml容量瓶中，用蒸馏水定容（注意，缓冲溶液一定要加在蜂蜜与氯化钠溶液混合之前）。 
      Ⅱ．淀粉溶液的标定：取上述已配制好的淀粉溶液5.0ml于10ml 40℃的蒸馏水中，充分混合。取此溶液1.0ml加入已盛有10ml 0.0007mol/L碘溶液的试管中，用35ml蒸馏水稀释并充分混合，于分光光度计660nm波长处，用lcm的比色池，以蒸馏水为空白对照，读取吸光度。吸光度应为0.760±0.020，必要时调节加蒸馏水的量，使吸光度达到要求，并记下加水总量V (ml)。 
      Ⅲ，样液的测定：准确吸取lOml蜂蜜样液于试管中，置于(40±0.2)℃的水浴中，15min后取5.0ml 40℃的淀粉溶液于蜂蜜样液中，混匀（并开始记时，每隔5min，吸取此液lml，加入事先盛有10 ml 0.0007mol/L碘溶液和Vml蒸馏水的试管中），立即于660nto波长处，以蒸馏水为空白对照，用1cm比色池测定其吸光度并记录读数。继续每隔5 min取lml重复上述操作测定其吸光度，直至吸光度低于0.235。 
      ④计算：将吸光度(A)和对应的时间(t) ( min)在坐标纸上标出。连接各点（至少要最后3点）作出标准曲线。从曲线上查出吸光度(A)降至0.235时所需要的时间，再根据式(9 -8)计算蜂蜜中淀粉酶值。 
      淀粉酶值=300/吸光度达到0.235时所需的时间 (9-8)